中性蛋白酶测试盒

中性蛋白酶测试盒

测定意义与原理

测定意义

中性蛋白酶（NP）是一种蛋白内切酶，在一定的温度和中性pH条件下，能将大分子蛋白质分解为多肽及氨基酸等产物。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养品生产。其活性检测具有重要意义：临床诊断：诊断和监测糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解糖酵解途径、细胞凋亡和细胞增殖机制药物研发：筛选糖酵解途径抑制剂，用于治疗癌症和代谢疾病工业应用：用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产

测定原理

中性条件下，NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在680nm有特征吸收峰。通过测定680nm处吸光度的增加速率，计算NP活性。反应式如下： 酪蛋白→NP酪氨酸+其他氨基酸酪蛋白NP酪氨酸+其他氨基酸 酪氨酸+磷钼酸→钨蓝酪氨酸+磷钼酸→钨蓝

试剂盒组成

分光光度法/微量法/比色法试剂盒

组分 规格 作用说明

提取液 液体60mL×1瓶 用于提取样本中的NP

试剂一 液体45mL×1瓶 含反应缓冲液，用于提供适宜的反应pH环境

试剂二 粉剂×1瓶 含酪蛋白溶液，反应底物

试剂三 粉剂×1瓶 含磷钼酸溶液，反应辅助因子

标准品 1mL×1支 含酪氨酸标准液，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗NP单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗NP抗体

标准品 液体1mL×6管 含0.156-10ng/mL NP标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/微量法/比色法：紫外分光光度计/酶标仪/可见分光光度计、1mL石英比色皿/96孔板/1mL玻璃比色皿、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、研钵、电子天平、磁力搅拌器

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机、可调式移液器、台式离心机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

细菌或培养细胞样本收集：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清破碎：按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

组织样本取样：按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆离心：8000g 4℃离心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待测

血清/血浆/培养液样本

血清(浆)/培养液样品：直接检测

土壤样本称样：称取1.0g新鲜土壤样本，置于50mL离心管中提取：加入20mL提取液，振荡提取30min离心：8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

测定操作步骤

分光光度法/微量法/比色法操作仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到680nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂二：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用

试剂三：临用前加入1.5mL蒸馏水充分溶解备用样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 对照管 测定管

蒸馏水/样本/样本 100 100 100

试剂一 700 700 700

试剂二 100 100 -

试剂三 - - 100

混匀后立即记录680nm处反应5min时的吸光值A1和10min时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1

对照管操作：先加试剂二，后加试剂三

测定管操作：先加试剂三，后加试剂二标准曲线绘制：将酪氨酸标准品稀释成0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol/L系列浓度，同样处理，测定10min内吸光度变化，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟生成1nmol酪氨酸的酶量

U/g 鲜重：每克组织每分钟生成1nmol酪氨酸的酶量

U/L：每升样本每分钟生成1nmol酪氨酸的酶量

分光光度法/微量法/比色法计算公式

NP活性(nmol/min/mgprot)=C标准品×(ΔA测定管−ΔA对照管)(ΔA标准管−ΔA空白管)×Cpr×T×V反总V1NP活性(nmol/min/mgprot)=(ΔA标准管−ΔA空白管)×Cpr×TC标准品×(ΔA测定管−ΔA对照管)×V1V反总

ΔA测定管：测定管吸光度变化值

ΔA对照管：对照管吸光度变化值

ΔA标准管：标准管吸光度变化值

ΔA空白管：空白管吸光度变化值

C标准品：标准品浓度（0.25μmol/mL）

V反总：反应体系总体积（L）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

T：反应时间（min）

V1：样本体积（L）

ELISA法计算公式

NP含量(ng/mL)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数NP含量(ng/mL)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 分光光度法/微量法/比色法/ELISA法

线性范围 0~50U/L

最低检测限 ≤0.1U/L

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤1.7%

批间精密度 CV≤5.0%

稳定性 2-8℃保存6-12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免NP失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

土壤样本需新鲜采集，避免酶失活

试剂使用：

试剂需临用前配制，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）

加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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