酪氨酸解氨酶(TAL)测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

酪氨酸解氨酶（TAL，EC4.3.1.5）是一种关键的氨基转移酶，主要功能包括：苯丙烷代谢：催化酪氨酸脱氨生成对香豆酸，进入苯丙烷代谢途径，参与木质素、黄酮类等次生代谢物的合成植物抗逆性：响应生物和非生物胁迫，增强植物抗病性和抗逆能力天然产物合成：在微生物发酵中用于生产对香豆酸、阿魏酸等重要的食品和医药中间体疾病诊断：某些细菌感染时，血清中TAL活性升高，可作为感染诊断指标

测定原理

采用分光光度法，TAL催化酪氨酸脱氨生成对香豆酸，对香豆酸在310nm波长处有特征吸收峰，通过测定吸光度变化计算TAL活力。反应式如下： L-酪氨酸→TAL对香豆酸+NH3L-酪氨酸TAL对香豆酸+NH3

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂一 25mL×1瓶/50mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5，用于反应体系构建

试剂二 10mL×1瓶/20mL×1瓶 含10mmol/L L-酪氨酸溶液，反应底物

试剂三 100mL×1瓶 含0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.5，用于样本提取

试剂四 1mL×1支/2mL×1支 含100U TAL标准品，用于建立标准曲线

提取辅助剂 液体10mL×1瓶 含0.1% Triton X-100，用于细胞膜破膜和酶提取

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度计/酶标仪（310nm检测通道）

低温离心机（≥8000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

必备耗材

1mL石英比色皿（或UV透明的塑料比色皿）/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

手术剪/镊子（用于组织样本处理）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（0.85% NaCl）

液氮（可选，用于植物样本速冻）

样本前处理方法

植物组织样本取新鲜植物组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL预冷提取液（试剂三）+ 10μL提取辅助剂，冰浴匀浆8000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若TAL活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定

微生物样本收集对数生长期微生物细胞，8000g 4℃离心5min弃上清按照微生物细胞数量(10⁴个):提取液体积(mL)=500~1000:1的比例（建议500万微生物细胞加入1mL提取液）+ 10μL提取辅助剂，冰浴超声波破碎细胞（功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）8000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测

发酵液/食品样本发酵液：8000g 4℃离心10min，取上清液直接测定，或用提取液适当稀释固体食品：研碎后加入10倍体积的提取液，冰浴提取30min，过滤或离心取上清液体食品：直接取上清液测定，或用提取液适当稀释

测定操作步骤

分光光度法操作

试剂准备：

试剂一：液体25mL×1瓶，4℃保存

试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存，用时加10mL蒸馏水溶解

试剂三：液体100mL×1瓶，4℃保存

工作液：试剂一 + 试剂二，按体积比9:1混合，现配现用

预温育：

分光光度计预热30min，调节波长到310nm，用试剂一调零

工作液在30℃（植物）或37℃（微生物）水浴中预热10min以上

反应启动：

取石英比色皿，依次加入工作液950μL + 样本50μL

立即混匀，记录310nm波长下0min（A1）和10min（A2）时的吸光度值

计算ΔA：ΔA = A2 - A1

微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液95μL + 样本5μL30℃（植物）或37℃（微生物）预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，310nm处连续读取20个循环（每1min读取1次）计算吸光度上升速率（ΔA/10min）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每克组织鲜重每分钟催化1μmol L-酪氨酸脱氨反应的酶量

U/mL：每毫升样本每分钟催化1μmol L-酪氨酸脱氨反应的酶量

U/mgprot：每毫克蛋白每分钟催化1μmol L-酪氨酸脱氨反应的酶量

计算公式

TAL活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TTAL活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总

ΔA：10min内吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：对香豆酸摩尔消光系数（6.4 L/(μmol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样测：测定时加入样本体积（0.05mL）

T：反应时间（10min）

简化公式

按鲜重计算：TAL（U/g鲜重）= 2.44 × ΔA ÷ W

按液体体积计算：TAL（U/mL）= 2.44 × ΔA

按蛋白含量计算：TAL（U/mgprot）= 2.44 × ΔA ÷ Cpr

性能指标

指标 要求

线性范围 0~20U/mL，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤0.05U/mL

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 4℃保存12个月，活性保留≥90%

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，TAL在低温下活性稳定，但反复冻融会导致活性下降

匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

样本提取后应立即测定，避免酶失活

试剂使用：

L-酪氨酸溶液对光敏感，配制后需避光保存，一周内用完

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

工作液需现配现用，室温下放置时间不超过2小时

测定过程：

反应温度需严格控制：植物样本30℃，微生物37℃

若ΔA值大于0.5，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置至少3个平行实验，结果取平均值

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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