线粒体活性氧产生速率（ROS）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

线粒体是细胞内ROS的主要产生部位，约95%的细胞ROS来自线粒体电子传递链的泄漏。ROS水平异常与多种生理病理过程密切相关：氧化应激：ROS过量积累导致蛋白质、脂质和核酸氧化损伤细胞凋亡：ROS参与调控细胞凋亡信号通路，促进细胞程序性死亡疾病关联：与神经退行性疾病、心血管疾病、癌症等密切相关衰老机制：ROS介导的氧化损伤是细胞衰老的重要驱动力

测定原理

采用荧光探针DCFH-DA（2',7'-二氯荧光素二乙酸酯），可自由透过线粒体膜，在线粒体内被酯酶水解为无荧光的DCFH。DCFH迅速与ROS反应生成强绿色荧光物质DCF（2',7'-二氯荧光素），其荧光强度与ROS水平成正比。通过监测荧光强度随时间的变化，计算ROS产生速率。反应式如下： DCFH-DA→酯酶DCFH→ROSDCF (荧光产物)DCFH-DA酯酶DCFHROSDCF (荧光产物)

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

试剂一 液体120mL×1瓶 线粒体提取缓冲液，4℃保存，用于样本组织/细胞的初始匀浆和细胞破碎

试剂二 液体50mL×1瓶 线粒体悬浮缓冲液，4℃保存，用于提取后线粒体的重悬和洗涤

试剂三 液体1.5mL×1瓶 蛋白酶抑制剂混合液，-20℃保存，防止提取过程中线粒体蛋白降解

试剂七 粉剂×2瓶 DCFH-DA荧光探针，-20℃避光保存，临用前需用试剂八溶解并稀释

试剂八 液体1mL×1支 探针溶解液，4℃保存，用于溶解DCFH-DA粉剂

自备仪器与试剂

必备仪器

多功能酶标仪（激发光499nm，发射光521nm）

恒温培养箱（37℃）

台式高速离心机（≥11000g）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

冰浴匀浆器/研钵

必备耗材

黑色不透光96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

手术剪/镊子（用于组织样本处理）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（0.85% NaCl）

抗凝剂（肝素/EDTA，仅用于血浆样本）

样本前处理方法

线粒体提取（通用方法）组织样本：准确称取0.1g新鲜组织，加入1mL试剂一和10μL试剂三，冰浴匀浆细胞样本：收集500万细胞，加入1mL试剂一和10μL试剂三，冰浴超声破碎低速离心：600g，4℃离心5min，弃沉淀（细胞核、未破碎细胞等）高速离心：11000g，4℃离心10min，弃上清（胞浆成分）重悬线粒体：沉淀中加入200μL试剂二，轻轻吹打重悬，置冰上待测

直接检测法（无需提取线粒体）贴壁细胞：弃培养基，用PBS洗涤2次，直接加入含探针的工作液悬浮细胞：离心收集细胞，PBS洗涤2次，重悬于含探针的工作液中组织切片：新鲜切片直接浸入含探针的工作液中孵育

测定操作步骤

荧光酶标仪法操作

试剂准备：

试剂一：线粒体提取缓冲液，4℃保存

试剂二：线粒体悬浮缓冲液，4℃保存

试剂三：蛋白酶抑制剂混合液，-20℃保存

试剂七：DCFH-DA荧光探针，-20℃避光保存，临用前每瓶加100μL试剂八溶解，再用试剂二稀释300倍

试剂八：探针溶解液，4℃保存

工作液：试剂二 + 试剂七（稀释后），按体积比100:1混合，现配现用

预温育：

多功能酶标仪预热30min，调节激发光499nm，发射光521nm

工作液在37℃恒温培养箱中预热10min以上

反应启动：

测定管：黑色96孔板每孔加入线粒体悬液20μL + 工作液180μL

空白管：黑色96孔板每孔加入试剂二20μL + 工作液180μL

轻轻摇匀，37℃避光孵育15min

荧光测定：

在37℃恒温下，连续测定10min内的荧光强度变化

每1min记录一次荧光值，共记录10个数据点

速率计算：

对荧光强度随时间变化的数据点进行线性回归拟合，计算斜率（k）

实际ROS产生速率 = k测定 - k空白

结果计算方法

单位定义

RFU/min·mg蛋白：每分钟每毫克线粒体蛋白产生的荧光单位数

RFU/min·10⁶细胞：每分钟每百万细胞产生的荧光单位数

RFU/min·mg组织：每分钟每毫克组织产生的荧光单位数

计算公式

ROS产生速率(RFU/min)=F10−F010ROS产生速率(RFU/min)=10F10−F0

F₁₀：10min时的荧光强度

F₀：0min时的荧光强度

10：测定时间（min）

蛋白归一化计算

标准化ROS速率(RFU/min\cdotpmg蛋白)=ROS产生速率线粒体蛋白浓度(mg/mL)标准化ROS速率(RFU/min\cdotpmg蛋白)=线粒体蛋白浓度(mg/mL)ROS产生速率

性能指标

指标 要求

线性范围 0~10000 RFU，线性相关系数r≥0.995

最低检测限 ≤10 RFU

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 4℃保存12个月，荧光信号保留≥90%

注意事项

样本处理：

需新鲜制备样本，避免样本冷冻导致线粒体破裂

线粒体提取过程需全程冰浴操作，防止酶失活

提取后线粒体悬液需立即检测，4℃保存不超过4小时

试剂使用：

DCFH-DA探针对光敏感，配制和使用过程需避光

探针工作液需现配现用，常温下1小时内有效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

必须使用黑色不透光96孔板，防止荧光干扰

孵育过程需严格避光，避免环境光导致荧光淬灭

每个样本需设置至少3个平行孔，结果取平均值

质量控制：

每次实验需设置空白对照和阳性对照（H₂O₂处理样本）

定期校准酶标仪，确保荧光检测准确性

若结果偏差较大，需检查线粒体提取效率或探针活性

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