γ谷氨酰转肽酶(γGT)测定测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT，EC2.3.2.2）是γ-谷氨酰循环中的关键酶，主要功能包括：谷胱甘肽代谢：催化谷胱甘肽（GSH）降解，参与γ-谷氨酰基的转移和水解疾病诊断：肝胆疾病（如肝炎、肝硬化、肝癌）时血清γ-GT活性显著升高；肾、胰、肺等器官病变也可导致γ-GT活性改变临床鉴别：尿、血γ-GT检测有助于肾病与尿路感染、肝胆胰疾病的鉴别诊断细胞生物学：作为细胞分化、老化的检测指标，反映组织细胞病变情况

测定原理（分光光度法）

γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺的γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸，生成黄色产物对硝基苯胺： γ-谷氨酰对硝基苯胺+N-甘氨酰甘氨酸→γ-GT对硝基苯胺+谷氨酰-甘氨酰甘氨酸γ-谷氨酰对硝基苯胺+N-甘氨酰甘氨酸γ-GT对硝基苯胺+谷氨酰-甘氨酰甘氨酸 对硝基苯胺在405nm处有特征吸收峰，通过测定405nm光吸收增加速率，计算γ-GT酶活性。

试剂盒组成

分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 液体×1瓶 缓冲液，用于样本提取和反应体系构建

试剂二 粉剂×1瓶 含谷氨酰对硝基苯胺，γ-GT底物，需用试剂一溶解配制工作液

试剂三 液体×1瓶 含N-甘氨酰甘氨酸，γ-GT反应受体

试剂四 液体×1瓶 提取液，用于组织/细胞样本前处理

标准品 粉剂×1支 对硝基苯胺标准品，用于建立标准曲线

ELISA试剂盒（96T）

组分 规格 作用说明

微孔酶标板 12孔×8条 预包被抗人γ-GT抗体

标准品 冻干品×1支 人γ-GT标准品，浓度梯度0、25、50、100、200、400U/L

检测抗体-HRP 10mL×1瓶 辣根过氧化物酶标记的抗γ-GT抗体

样本稀释液 20mL×1瓶 用于样本稀释和标准品复溶

洗涤缓冲液 25mL×1瓶 20×浓缩液，用于洗涤酶标板

底物A/B液 6mL×2瓶 TMB显色液，用于HRP催化显色反应

终止液 6mL×1瓶 2M硫酸溶液，终止显色反应

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法：可见分光光度计、低温离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿

ELISA法：酶标仪（450nm/630nm）、洗板机、恒温培养箱、单道/多道移液器

通用：-20℃冰箱、电子天平、漩涡混匀器

必备耗材

分光光度法：离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

ELISA法：一次性吸头、封板膜、96孔板架

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、液氮（可选）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分按质量(g):提取液(mL)=1:5~10比例（建议0.1g组织加1mL提取液）冰浴匀浆8000g 4℃离心15min，取上清置冰上待测酶活性过高时，可用提取液稀释1-5倍测定

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清按细胞数(10⁴):提取液(mL)=500~1000:1比例加入提取液，冰浴超声破碎8000g 4℃离心15min，取上清置冰上待测

血清/血浆/尿液样本血清：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清直接测定血浆：加入肝素/EDTA抗凝后，3000g 4℃离心10min，取上清直接测定尿液：新鲜尿液3000g 4℃离心10min，取上清直接测定或用生理盐水稀释

测定操作步骤

分光光度法操作

试剂准备：

配制工作液：取试剂一9mL + 试剂二1瓶 + 试剂三1mL，充分溶解混匀

将工作液置于25℃（一般物种）或37℃（哺乳动物）水浴预热30min

标准曲线建立：

稀释标准品至0、50、100、200、400、800μmol/L

取比色皿，加入100μL标准品 + 900μL工作液，405nm测定吸光度

绘制标准曲线：y=0.006x+0.0016（y为吸光度，x为对硝基苯胺浓度）

样本测定：

分光光度计预热30min，405nm波长，蒸馏水调零

测定管：取1mL比色皿，加入100μL样本 + 900μL工作液，混匀后测定10s（A1）和70s（A2）吸光度

空白管：100μL提取液 + 900μL工作液，相同方法测定吸光度（A空1、A空2）

ELISA法操作

试剂准备：

将试剂盒平衡至室温（20-25℃）

配制洗涤液：20×浓缩液加蒸馏水稀释至1×工作液

加样：

空白孔加100μL样本稀释液，标准品/样本孔加100μL标准品/样本

封板膜封板，37℃温育30min

孵育与显色：

弃孔内液体，洗涤3次，拍干后加入100μL检测抗体-HRP

37℃温育30min，洗涤5次，拍干后加入底物A、B液各50μL

避光37℃显色15min，加入50μL终止液终止反应

读数：

酶标仪450nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度（OD值）

活性计算方法

分光光度法计算公式

γ-GT活性(μmol/min/mgprot)=(A2−A1)−(A空2−A空1)−0.00160.006×V反总Cpr×V样测×Tγ-GT活性(μmol/min/mgprot)=0.006(A2−A1)−(A空2−A空1)−0.0016×Cpr×V样测×TV反总

A2-A1：样本1min内吸光度变化值

V反总：反应总体积（1.0mL）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样测：测定用样本体积（0.1mL）

T：反应时间（1min）

简化公式

按蛋白计算：γ-GT（μmol/min/mgprot）= 1.67×[(A2-A1)-0.0016]÷Cpr

按鲜重计算：γ-GT（μmol/min/g鲜重）= 1.67×[(A2-A1)-0.0016]÷W

按液体体积计算：γ-GT（μmol/min/mL）= 1.67×[(A2-A1)-0.0016]

ELISA法计算根据标准品OD值绘制标准曲线，拟合回归方程根据样本OD值，从标准曲线查得γ-GT浓度（U/L）若样本已稀释，需乘以稀释倍数得到实际浓度

性能指标

指标 分光光度法要求 ELISA法要求

线性范围 0~1000μmol/L，R²≥0.995 0~400U/L，R²≥0.99

检测下限 ≤5μmol/L ≤5U/L

批内精密度 CV≤5.0% CV≤8.0%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤10.0%

回收率 90%~110% 95%~105%

注意事项

样本处理：

血清/血浆样本避免溶血，溶血会导致γ-GT活性偏高

组织/细胞样本需冰浴处理，避免酶失活；-80℃可保存1个月

尿液样本需新鲜检测，或-20℃保存，避免细菌繁殖影响结果

试剂使用：

分光光度法工作液需现配现用，25℃可稳定4小时

ELISA试剂避免反复冻融，稀释后试剂需在1周内用完

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

分光光度法反应温度严格控制在25℃或37℃，温度影响酶活性

ELISA加样需准确，避免交叉污染；温育时间需严格控制

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

正式测定前选择2-3个预期差异大的样本做预测定

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

公司正在出售的产品