硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用，功能与GPX类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内，酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫甚至细菌和古细菌体内都含有该酶，在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。

测定原理

TPX催化H₂O₂氧化二硫苏糖醇(DTT)，H₂O₂的吸收波长为240nm，通过测定240nm波长处吸光度的下降速率，即可计算出TPX活性。 H2O2+DTT→TPXH2O+ox-DTTH2O2+DTTTPXH2O+ox-DTT

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪（240nm检测通道）

低温离心机（≥8000g）

水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调节移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）

必备耗材

1mL石英比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/双蒸水

生理盐水（0.85% NaCl）

液氮（用于样本速冻）

样本前处理方法

动植物组织样本取新鲜组织，用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分称取约0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释1-5倍后测定

细菌/真菌样本收集对数生长期细胞/细菌，8000g 4℃离心5min弃上清按照细胞数量(10⁴个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）8000g 4℃离心10min，取上清置于冰上待测

血清/血浆样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取血清上清血浆样本：加入抗凝剂（肝素/EDTA）后3000g 4℃离心10min，取上清样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释

测定操作步骤

紫外分光光度法操作

试剂准备：

试剂一：液体5mL×1瓶，4℃保存

试剂二：液体1.5mL×1支，-20℃保存

试剂三：粉剂×1支，4℃保存；临用前加入1.6mL双蒸水，混匀，4℃保存一周

检测工作液：试剂一1.0mL + 试剂二50μL + 试剂三50μL，现配现用

检测工作液置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中预热10min以上

预温育：

分光光度计预热30min，调节波长到240nm，用蒸馏水调零

试剂一和试剂二置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热30min以上

反应启动：

CAT活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL试剂一，80μL试剂三，迅速混匀后于240nm测定10s和130s吸光度，分别为A1和A2，计算ΔA_CAT = A1 - A2

总活性测定管：取1mL石英比色皿，加入20μL上清液，900μL试剂二，80μL试剂三，迅速混匀后于240nm测定10s和130s吸光度，分别为A3和A4，计算ΔA_总 = A3 - A4

TPX活性ΔA：ΔA_TPX = ΔA_总 - ΔA_CAT

微量法（酶标仪）操作96孔板每孔加入：工作液90μL + 样本10μL37℃预温育5min，加入样本后立即混匀设置动力学模式，240nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟分解1μmol H₂O₂的酶量

U/mL：每mL样本每分钟分解1μmol H₂O₂的酶量

U/mgprot：每mg蛋白每分钟分解1μmol H₂O₂的酶量

计算公式

TPX活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×V样总ε×d×Cpr×V样测×TTPX活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样测×TΔA×V反总×V样总

ΔA：120s内吸光度变化值

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：H₂O₂摩尔消光系数（43.6 L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样测：测定时加入样本体积（0.02mL）

T：反应时间（2min）

简化公式

组织样本：TPX（U/g鲜重）= 1.148 × ΔA ÷ W

液体样本：TPX（U/mL）= 1.148 × ΔA

蛋白样本：TPX（U/mgprot）= 1.148 × ΔA ÷ Cpr

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免酶失活；-80℃可保存1个月

匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，控制温度在0-4℃

样本需避免氧化，处理过程中尽量减少与空气接触

试剂使用：

试剂三配制后需避光保存，4℃可稳定一周

检测工作液需现配现用，避免氧化

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

反应温度严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（植物）

若ΔA值大于0.3，需稀释样本后重新测定

每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算

质量控制：

每次实验设置空白对照（提取液替代样本）和阳性对照

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确

正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定

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