线粒体柠檬酸(MCA）含量测试盒 新品

线粒体柠檬酸(MCA）含量测试盒

测定意义与原理

测定意义

线粒体柠檬酸（MCA）是线粒体三羧酸循环的第一个中间产物，由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。配合测定丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性、乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量，可全面反映细胞能量代谢状态：糖酵解分析：丙酮酸含量和丙酮酸脱氢酶活性变化可反映糖酵解进行程度脂肪酸代谢分析：综合分析丙酮酸含量、丙酮酸脱氢酶活性和乙酰CoA含量变化可反映脂肪酸β-氧化途径提供的乙酰CoA情况三羧酸循环分析：乙酰CoA含量、柠檬酸合酶活性和CA含量变化可反映三羧酸循环进行状况

测定原理

CA在柠檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性条件下，α-酮酸进一步与苯肼反应，生成相应的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在330nm处有吸收峰，该波长下吸光度的变化程度可反映出CA的含量。

试剂盒组成

组分 规格 作用说明

酸性提取液 25mL/50mL/100mL×1瓶 用于提取线粒体柠檬酸

碱性提取液 25mL/50mL/100mL×1瓶 用于中和酸性提取液，调节pH值

试剂一 7.5mL/15mL×1瓶 含柠檬酸裂解酶，催化柠檬酸生成草酰乙酸

试剂二 2.5mL×1瓶 含苯肼，与α-酮酸反应生成腙类化合物

试剂三 粉剂×1瓶 含稳定剂，稳定酶活性

标准品 1mL×1支 含10μmol/mL柠檬酸标准液，用于建立标准曲线

自备仪器与试剂

必备仪器

分光光度法/比色法：可见分光光度计、1mL石英比色皿、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水

微量法：酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器、超声破碎仪

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取0.05~0.1g样本，加入0.5mL酸性提取液，冰上充分研磨低速离心：600g 4℃离心5min，取上清至另一EP管中高速离心：11000g 4℃离心10min，弃上清线粒体破碎：向沉淀中加入0.5mL酸性提取液，充分悬浮溶解，超声波破碎（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）中和处理：取此溶液300μL和300μL碱性提取液中和，混匀，置冰上待测蛋白浓度测定：另取组织测定蛋白浓度，可用考马斯亮蓝法或BCA法

细胞样本收集：收集500万细胞，加入0.5mL酸性提取液匀浆：冰浴匀浆低速离心：600g 4℃离心5min，取上清至另一EP管中高速离心：11000g 4℃离心10min，弃上清线粒体破碎：向沉淀中加入0.5mL酸性提取液，充分悬浮溶解，超声波破碎（功率20%，超声3秒，间隔10秒，重复30次）中和处理：取此溶液300μL和300μL碱性提取液中和，混匀，置冰上待测

测定操作步骤

仪器预热：分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到330nm，蒸馏水调零试剂配制：

试剂三：临用前加入6mL蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存试剂预热：试剂一、二和三37℃预热10min样本测定：

试剂名称(μL) 空白管 标准管 测定管

试剂一 60 60 60

蒸馏水/标准液/样本 60 60 60

试剂二 20 20 20

试剂三 60 60 60

充分混匀，330nm立即测定初始吸光值A1和37℃孵育30min后的吸光值A2，ΔA=A2–A1

结果计算方法

单位定义

μmol/mg prot：每毫克组织蛋白中线粒体柠檬酸的含量

μmol/g 鲜重：每克鲜重样本中线粒体柠檬酸的含量

μmol/L：每升样本中线粒体柠檬酸的含量

计算公式

柠檬酸含量(μmol/mg prot)=C标准管×(ΔA测定管−ΔA空白管)(ΔA标准管−ΔA空白管)×Cpr×V样总V样柠檬酸含量(μmol/mg prot)=(ΔA标准管−ΔA空白管)×CprC标准管×(ΔA测定管−ΔA空白管)×V样V样总 柠檬酸含量(μmol/g 鲜重)=C标准管×(ΔA测定管−ΔA空白管)(ΔA标准管−ΔA空白管)×W×V样总V样柠檬酸含量(μmol/g 鲜重)=(ΔA标准管−ΔA空白管)×WC标准管×(ΔA测定管−ΔA空白管)×V样V样总

C标准管：标准液浓度（10μmol/mL）

ΔA测定管：测定管吸光度变化值

ΔA空白管：空白管吸光度变化值

ΔA标准管：标准管吸光度变化值

Cpr：样品蛋白浓度（mg/mL）

W：样本质量（g）

V样总：样本提取液总体积（mL）

V样：测定时取用样本体积（mL）

性能指标

指标 分光光度法/比色法/微量法

线性范围 0~10μmol/mL

最低检测限 ≤1nmol/mg prot 或 ≤1μmol/g 鲜重

回收率 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0%

批间精密度 CV≤8.0%

稳定性 2-8℃保存12个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免柠檬酸降解；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

超声波破碎时需控制功率和时间，避免线粒体过度破碎

试剂使用：

试剂三需临用前配制，避免失效

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

标准品需4℃保存，避免反复冻融

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃，反应时间30分钟

加入试剂后需充分混匀，确保反应完全

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

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