琥珀酸脱氢酶（SDH)测试盒

琥珀酸脱氢酶（SDH)测试盒

测定意义与原理

测定意义

琥珀酸脱氢酶（SDH, EC 1.3.5.1）是线粒体的一种标志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。其测定具有重要的临床和科研价值：临床诊断：诊断和监测线粒体疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、组织损伤程度和治疗效果生物学研究：了解线粒体功能、细胞凋亡和细胞增殖机制环境监测：评估环境污染对生物线粒体的影响农业研究：筛选抗逆作物品种，提高作物产量食品检测：检测食品新鲜度和微生物污染程度

测定原理

比色法和紫外分光光度法基于SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原2,6-二氯酚靛酚（DCPIP），DCPIP在600nm处具有特征吸收峰，通过600nm吸光度的变化，测定DCPIP的还原速度，代表SDH酶活性。反应式如下： 琥珀酸+FAD→SDH延胡索酸+FADH2琥珀酸+FADSDH延胡索酸+FADH2 FADH2+PMS→FAD+PMSH2FADH2+PMS→FAD+PMSH2 PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2PMSH2+DCPIP→PMS+DCPIPH2

ELISA法基于抗原抗体特异性结合原理，通过检测样本中SDH的含量，间接反映SDH的活性。

试剂盒组成

比色法/紫外分光光度法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 25mL×1瓶 含琥珀酸钠溶液，反应底物

试剂二 25mL×1瓶 含PMS溶液，电子传递体

试剂三 10mL×1瓶 含DCPIP溶液，电子受体

试剂四 25mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的SDH

试剂五 粉剂×1瓶 含稳定剂，用于稳定SDH活性

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗SDH单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗SDH抗体

标准品 液体1mL×6管 含0、2、4、8、16、32、64U/L SDH标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

比色法/紫外分光光度法：可见分光光度计/酶标仪（600nm检测通道）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水、三氯乙酸

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.1-0.2g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例进行冰浴匀浆离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测稀释：若SDH活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，加入1mL试剂一破碎：冰浴超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清/血浆：直接测定；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍

尿液：离心去除沉淀，取上清液测定；或用提取液稀释10-20倍

测定操作步骤

比色法/紫外分光光度法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到600nm，用蒸馏水调零试剂配制：

试剂四：临用前加入18mL蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融

试剂五：临用前加入1mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融样品测定：

取10μL样本、10μL试剂五和180μL试剂四，混匀，立即记录600nm处0min和1min的光吸收值A1和A2，计算ΔA=A1-A2

同时设置空白对照，用蒸馏水替代样本，同样操作记录吸光值变化标准曲线绘制：将SDH标准品稀释成0、10、20、30、40、50U/L系列浓度，同样处理，测定1min内吸光值变化，绘制标准曲线

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化反应的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟催化反应的酶量

U/L：每升样本每分钟催化反应的酶量

比色法/紫外分光光度法计算公式

SDH活性(U/mg prot)=(ΔA样本−ΔA空白)×V总Cpr×V样×ε×d×T×106SDH活性(U/mg prot)=Cpr×V样×ε×d×T(ΔA样本−ΔA空白)×V总×106

ΔA样本：样本管吸光度变化值

ΔA空白：空白管吸光度变化值

V总：反应体系总体积（L）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：样本体积（L）

ε：DCPIP摩尔消光系数（L/mol/cm）

d：比色皿光径（cm）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

SDH含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数SDH含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 比色法/紫外分光光度法 ELISA法

线性范围 0~50U/L 0~64U/L

最低检测限 ≤0.1U/L ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免SDH失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

试剂四和试剂五需临用前配制，避免失效

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

比色法/紫外分光光度法反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种），反应时间1分钟

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

其他注意事项：

操作时需戴手套和口罩，避免接触皮肤和黏膜

所有试剂和样本需妥善处理，避免污染环境

试剂盒需在有效期内使用，过期试剂请勿使用

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