6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）/葡萄糖6磷酸脱氢酶测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

6磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH，EC1.1.1.49）是磷酸戊糖途径（PPP）的关键限速酶，主要功能包括：能量代谢：催化葡萄糖-6-磷酸氧化生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时生成NADPH抗氧化防御：NADPH是谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶的辅酶，维持细胞氧化还原稳态临床诊断：G6PDH缺乏是最常见的遗传性酶病，引起新生儿黄疸、溶血性贫血等疾病关联：G6PDH活性异常与肿瘤、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等相关工业应用：用于啤酒酿造、生物燃料生产等领域

测定原理

G6PDH催化葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP+还原为NADPH： G-6-P+NADP+→G6PDH6-磷酸葡萄糖酸内酯+NADPH+H+G-6-P+NADP+G6PDH6-磷酸葡萄糖酸内酯+NADPH+H+ NADPH在340nm处有特征吸收峰，通过监测吸光度增加速率计算G6PDH活性。

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）

台式高速离心机（≥12000rpm）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）

必备耗材

1mL石英比色皿/微量石英比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性无菌吸头

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（用于样本稀释）

液氮（用于样本速冻保存）

样本前处理方法

植物/动物组织样本新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）12000rpm 4℃离心20min，取上清液置冰上待测；若活性过高可稀释1-5倍

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞（密度1×10^6/mL）或细菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃离心5min弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细胞/细菌加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）10000rpm 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆/红细胞样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清红细胞样本：取抗凝血3000g离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤3次，按1:10比例加入蒸馏水溶血以上样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释

测定操作步骤

紫外分光光度法操作

试剂准备：

试剂一：反应缓冲液，直接使用

试剂二：NADP+溶液，使用前用蒸馏水稀释10倍

试剂三：葡萄糖-6-磷酸溶液，现配现用，-20℃可保存1周

试剂四：提取液，直接使用

预温育：

取比色皿，依次加入：试剂一920μL + 稀释后NADP+溶液20μL + 样本40μL

37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A1

反应启动：

加入底物溶液20μL，立即混匀，开始计时

分别记录1min（A2）、2min（A3）时的吸光度值

计算ΔA：ΔA = (A2 - A1) + (A3 - A2)

微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：试剂一92μL + 稀释后NADP+溶液2μL + 样本4μL37℃预温育5min，加入底物溶液2μL立即混匀设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol NADPH的酶量

U/mL：每mL液体样本每分钟生成1μmol NADPH的酶量

U/mgprot：每mg蛋白每分钟生成1μmol NADPH的酶量

U/10⁶cell：每100万个细胞每分钟生成1μmol NADPH的酶量

计算公式

G6PDH活性(U/mgprot)=ΔA×V反总×106ε×d×Cpr×V样×TG6PDH活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样×TΔA×V反总×106

ΔA：吸光度变化值（A3 - A1）

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：测定时加入的样本体积（0.04mL）

T：反应时间（2min）

简化公式

组织样本（蛋白浓度）：G6PDH（U/mgprot）= 20.1 × ΔA ÷ Cpr

组织样本（鲜重）：G6PDH（U/g鲜重）= 20.1 × ΔA ÷ W

液体样本：G6PDH（U/mL）= 20.1 × ΔA

细胞/细菌样本：G6PDH（U/10⁶cell）= 0.000201 × ΔA ÷ N

注意事项

样本处理：

G6PDH对温度敏感，所有操作需在冰浴中进行

样本需新鲜制备，-80℃保存不超过1个月

避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合

红细胞样本溶血后需立即检测，避免酶失活

试剂使用：

NADP+溶液对光敏感，配制后需避光保存

葡萄糖-6-磷酸溶液需现配现用，避免降解

不同批号试剂不能混用，需重新测定标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）

若ΔA值超出标准曲线范围，需调整稀释倍数重新测定

每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算

质量控制：

每次实验设置空白对照和阳性对照

定期校准分光光度计/酶标仪，确保波长准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确

公司正在出售的产品