商品属性
产品名称 | 乙醛脱氢酶（ALDH）测试盒 | 产品货号 | BH-961114 |
规格 | 100管/96样、50管/48样 | 产品分类 | 辅酶Ⅰ系列 |
测试方法 | 微量法、紫外分光光度法 | 用途 | 仅供科研实验 |
测定意义与原理
测定意义
乙醛脱氢酶（ALDH，EC1.2.1.10）是醛脱氢酶家族成员，核心功能包括：酒精代谢：催化乙醛氧化为乙酸，是人体酒精解毒的关键酶，与饮酒脸红、酒精耐受密切相关解毒功能：参与醛类物质解毒，维护细胞氧化还原稳态临床诊断：血清ALDH活性异常与肝脏疾病、心血管疾病、肿瘤等相关肿瘤干细胞标记：ALDH高表达是多种肿瘤干细胞的重要标志物工业应用：用于酿酒工艺优化、生物燃料生产等领域
测定原理
紫外分光光度法/微量法： 在辅酶Ⅰ（NAD+）存在的条件下，ALDH催化乙醛氧化为乙酸，同时将NAD+还原为NADH： 乙醛+NAD++H2O→ALDH乙酸+NADH+H+乙醛+NAD++H2OALDH乙酸+NADH+H+ NADH在340nm处有特征吸收峰，通过监测吸光度增加速率计算ALDH活性。
ELISA法： 采用双抗体夹心法，用纯化ALDH抗体包被微孔板，依次加入样本、HRP标记的ALDH抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，通过TMB底物显色，450nm处吸光度与ALDH含量成正比。
自备仪器与试剂
必备仪器
紫外分光光度计/酶标仪（340nm/450nm检测通道）
台式高速离心机（≥12000rpm）
恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）
可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）
超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）
必备耗材
1mL石英比色皿/微量石英比色皿/96孔板
离心管（1.5mL、10mL）
一次性无菌吸头
研钵/组织匀浆器（冰浴专用）
自备试剂
蒸馏水/去离子水
生理盐水（用于样本稀释）
液氮（用于样本速冻保存）
样本前处理方法
植物/动物组织样本新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）12000rpm 4℃离心20min，取上清液置冰上待测；若活性过高可稀释1-5倍
细胞/细菌样本收集对数生长期细胞（密度1×10^6/mL）或细菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃离心5min弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细胞/细菌加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）10000rpm 4℃离心10min，取上清液置冰上待测
血清/血浆/尿液样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清尿液样本：直接取上清，若浑浊需3000g离心5min后取上清以上样本可直接检测，无需提取处理；活性过高时可用生理盐水稀释
测定操作步骤
紫外分光光度法操作
试剂准备：
试剂一：反应缓冲液，直接使用
试剂二：NAD+溶液，使用前用蒸馏水稀释10倍
试剂三：乙醛溶液，现配现用，-20℃可保存1周
试剂四：提取液，直接使用
预温育：
取比色皿，依次加入：试剂一920μL + 稀释后NAD+溶液20μL + 样本40μL
37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A1
反应启动：
加入底物溶液20μL，立即混匀，开始计时
分别记录1min（A2）、2min（A3）时的吸光度值
计算ΔA：ΔA = (A2 - A1) + (A3 - A2)
ELISA法操作流程
试剂准备：
将浓缩洗涤液按比例稀释
配制系列浓度ALDH标准品
取出所需板条，剩余板条立即放回密封袋
加样：
标准品孔：加入不同浓度标准品50μL
样本孔：加入样本稀释液40μL + 样本10μL（终稀释度5倍）
空白孔：不加样本
温育：
除空白孔外，每孔加入HRP标记的检测抗体100μL
用封板膜封板，37℃温育60min
洗涤：
弃去孔内液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1min后弃去
重复洗涤5次，拍干
显色：
每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min
终止与测定：
每孔加入终止液50μL，蓝色立即转黄色
在450nm波长处测定各孔OD值
酶活力计算方法
单位定义
U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟转化1μmol乙醛的酶量
U/mL：每mL液体样本每分钟转化1μmol乙醛的酶量
U/mgprot：每mg蛋白每分钟转化1μmol乙醛的酶量
U/10⁶cell：每100万个细胞每分钟转化1μmol乙醛的酶量
计算公式（紫外分光光度法）
ALDH活性(U/g鲜重)=ΔA×V反总×V样总ε×d×W×T×V样测ALDH活性(U/g鲜重)=ε×d×W×T×V样测ΔA×V反总×V样总
ΔA：1min内吸光度变化值
V反总：反应体系总体积（1.0mL）
V样总：样本提取液总体积（mL）
ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）
d：比色皿光径（1cm）
W：组织鲜重（g）
T：反应时间（1min）
V样测：测定时加入样本体积（0.04mL）
简化公式
组织样本（蛋白浓度）：ALDH（U/mgprot）= 40.2 × ΔA ÷ Cpr
组织样本（鲜重）：ALDH（U/g鲜重）= 40.2 × ΔA ÷ W
液体样本：ALDH（U/mL）= 40.2 × ΔA
细胞/细菌样本：ALDH（U/10⁶cell）= 0.000402 × ΔA ÷ N
ELISA法计算
以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线
根据样本OD值从标准曲线上查出相应浓度，乘以稀释倍数
注意事项
样本处理：
ALDH对温度敏感，所有操作需在冰浴中进行
样本需新鲜制备，-80℃保存不超过1个月
避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合
溶血、脂血样本会影响检测结果，避免使用
试剂使用：
NAD+溶液对光敏感，配制后需避光保存
乙醛溶液需现配现用，避免挥发
ELISA试剂需在室温平衡15-30分钟后使用
不同批号试剂不能混用，需重新测定标准曲线
测定过程：
反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）
若ΔA值超出标准曲线范围，需调整稀释倍数重新测定
ELISA法需在加终止液后15分钟内完成测定
每个样本需设置3个平行孔，取平均值计算
质量控制：
每次实验设置空白对照和阳性对照
定期校准分光光度计/酶标仪，确保波长准确性
若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确
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