单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR，EC1.6.5.4）是抗坏血酸氧化还原代谢的关键酶，主要功能包括：抗氧化防御：催化单脱氢抗坏血酸（MDHA）还原为抗坏血酸（AsA），维持细胞内AsA库稳定ROS清除：与抗坏血酸过氧化物酶（APX）协同作用，清除活性氧（ROS）胁迫响应：参与植物对干旱、高温、低温、盐胁迫等逆境的适应性调节疾病关联：与氧化应激相关疾病（如心血管疾病、神经退行性疾病）的发生发展相关

测定原理

MDHAR以NADH为电子供体，催化MDHA还原为AsA： MDHA+NADH+H+→MDHARAsA+NAD+MDHA+NADH+H+MDHARAsA+NAD+ NADH在340nm处有特征吸收峰，NAD+无此吸收，通过监测340nm处吸光度下降速率计算MDHAR活性。

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪（340nm检测通道）

台式高速离心机（≥10000rpm）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细胞/细菌样本）

必备耗材

1mL石英比色皿/微量石英比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性吸头（无菌无酶）

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（用于样本稀释）

液氮（用于样本速冻保存）

样本前处理方法

植物/动物组织样本新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）10000rpm 4℃离心10min，取上清液置冰上待测；若活性过高可稀释1-5倍

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞（密度1×10^6/mL）或细菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃离心5min弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细胞/细菌加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）10000rpm 4℃离心20min，取上清液置冰上待测

血清/血浆/尿液样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清尿液样本：直接取上清，若浑浊需3000g离心5min后取上清以上样本可直接检测，无需提取处理

测定操作步骤

比色法操作流程

试剂准备：

试剂一（提取液）：直接使用

试剂二（NADH溶液）：-20℃保存，使用前用蒸馏水稀释至0.2mmol/L

试剂三（MDHA溶液）：临用前加入3mL蒸馏水充分溶解

试剂四（反应缓冲液）：临用前加入2.5mL蒸馏水充分溶解

预温育：

石英比色皿中加入：提取液900μL + 稀释后NADH溶液20μL + MDHA溶液20μL + 样本20μL

25℃预温育5min，记录初始吸光度A0

反应与测定：

加入反应缓冲液10μL立即混匀，启动反应

连续记录340nm处吸光度变化，读取30s（A1）和150s（A2）时的吸光度

计算ΔA = A1 - A2

微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：提取液90μL + 稀释后NADH溶液2μL + MDHA溶液2μL + 样本2μL25℃预温育5min，加入反应缓冲液1μL立即混匀酶标仪设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每10s读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟氧化1μmol NADH的酶量

U/mgprot：每mg蛋白每分钟氧化1μmol NADH的酶量

U/10⁶cell：每100万个细胞每分钟氧化1μmol NADH的酶量

U/mL：每mL液体样本每分钟氧化1μmol NADH的酶量

计算公式

MDHAR活性(U/mgprot)=(ΔA测定管−ΔA空白管)×V反总×106ε×d×Cpr×V样×TMDHAR活性(U/mgprot)=ε×d×Cpr×V样×T(ΔA测定管−ΔA空白管)×V反总×106

ΔA：吸光度变化值（A1 - A2）

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

ε：NADH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

V样：测定时加入的样本体积（0.02mL）

T：反应时间（2min）

简化公式

组织样本（蛋白浓度）：MDHAR（U/mgprot）= 0.804 × ΔA ÷ Cpr

组织样本（鲜重）：MDHAR（U/g鲜重）= 0.804 × ΔA ÷ W

液体样本：MDHAR（U/mL）= 0.804 × ΔA

细胞/细菌样本：MDHAR（U/10⁶cell）= 0.000804 × ΔA ÷ N

注意事项

样本处理：

MDHAR对温度敏感，所有操作需在冰浴中进行

样本需新鲜制备，-80℃保存不超过1个月

避免样本接触金属离子，可用EDTA螯合

试剂使用：

NADH溶液对光敏感，配制后需避光保存，24小时内用完

MDHA溶液需临用现配，避免氧化失效

不同批号试剂不能混用，需重新测定标准曲线

测定过程：

反应温度需严格控制在25℃，避免温度影响酶活性

若ΔA值大于0.3，需将样本稀释后重新测定

空白对照需用提取液替代样本，扣除非酶反应背景

质量控制：

每次实验需设置阳性对照（已知活性的MDHAR酶）

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质、样本处理是否正确

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