NADH氧化酶（NOX）测试盒 新品

商品属性

测定意义与原理

测定意义

NADH氧化酶（NOX，EC1.6.3.1）是一类跨膜蛋白复合物，主要功能包括：活性氧（ROS）生成：催化NADH氧化生成O₂⁻，是细胞内ROS的主要来源信号转导：参与细胞增殖、分化、凋亡等生理过程的信号调节免疫防御：吞噬细胞通过NOX生成ROS杀灭病原体病理关联：NOX活性异常与心血管疾病、神经退行性疾病、肿瘤、糖尿病等密切相关

测定原理

NOX催化NADH氧化生成NAD+，同时将电子传递给O₂生成O₂⁻，通过偶联显色反应检测O₂⁻含量变化，计算酶活性： NADH+O2→NOXNAD++H2O2NADH+O2NOXNAD++H2O2 生成的O₂⁻与显色剂反应生成有色产物，在530nm处有特征吸收，吸光度增加速率与NOX活性成正比。

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计/酶标仪（具备530nm检测通道）

台式高速离心机（最大转速≥12000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细胞/细菌样本处理）

必备耗材

1mL玻璃比色皿/96孔板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性吸头（无菌无酶）

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（用于样本稀释）

液氮（用于样本速冻保存）

样本前处理方法

组织样本（动植物）新鲜样本取材后立即液氮速冻，-80℃保存；避免反复冻融称取0.05-0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷的提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）转移至离心管，12000g 4℃离心15min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释后测定（建议稀释倍数1-10倍）

细胞/细菌样本收集对数生长期细胞（密度1×10^6/mL）或细菌（OD600=0.6-0.8）8000g 4℃离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细胞/细菌加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率30%，超声5s，间隔10s，重复20次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆/尿液样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清尿液样本：直接取上清，若浑浊需3000g离心5min后取上清以上样本可直接检测，无需提取处理

测定操作步骤

比色法操作流程

试剂准备：

从4℃取出试剂盒，室温平衡20min

试剂A：显色剂，直接使用

试剂B：NADH溶液，使用前用蒸馏水稀释5倍

试剂C：反应缓冲液，直接使用

空白管设置：

取比色皿，依次加入：试剂C 900μL + 试剂B 50μL + 蒸馏水 50μL

37℃预温育5min，记录530nm处初始吸光度A0

样本测定：

另取比色皿，依次加入：试剂C 900μL + 试剂B 50μL + 样本 50μL

37℃预温育5min，立即记录530nm处吸光度A1

继续反应10min，记录吸光度A2

微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：试剂C 90μL + 试剂B 5μL + 样本 5μL37℃预温育5min，酶标仪设置动力学模式，530nm处连续读取10个循环（每1min读取1次）计算吸光度增加速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/mL：每mL样本每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量

U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量

U/10⁴cell：每1万个细胞每分钟生成1μmol O₂⁻的酶量

计算公式

NOX活性=(ΔA样本−ΔA空白)×V反总×V样总ε×d×V样测×T×CNOX活性=ε×d×V样测×T×C(ΔA样本−ΔA空白)×V反总×V样总

ΔA：吸光度变化值（A2 - A1）

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：显色产物摩尔消光系数（3.6×10⁴ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

V样测：测定时加入的样本体积（0.05mL）

T：反应时间（10min）

C：样本浓度（蛋白浓度mg/mL、组织鲜重g/mL、细胞数10⁴/mL）

简化公式

血清/血浆样本：NOX（U/mL）= 2.78 × ΔA

组织样本（蛋白浓度）：NOX（U/mgprot）= 2.78 × ΔA ÷ Cpr

组织样本（鲜重）：NOX（U/g鲜重）= 2.78 × ΔA ÷ W

细胞/细菌样本：NOX（U/10⁴cell）= 0.056 × ΔA

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免反复冻融；若无法立即检测，-80℃可保存2周

组织匀浆与超声破碎需在冰浴中进行，避免酶失活

离心时需控制温度与转速，确保充分分离细胞器

试剂使用：

试剂B（NADH）对光敏感，配制后需避光保存，24小时内用完

显色剂需现配现用，避免氧化失效

不同批号试剂禁止混用，避免影响检测结果

测定过程：

若ΔA值大于0.6，建议将样本稀释后重新测定

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）

测定前需用蒸馏水校正分光光度计零点

质量控制：

每次实验需设置空白对照、阴性对照与阳性对照

若结果偏差较大，需检查样本处理过程与试剂配制是否正确

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