NADP苹果酸脱氢酶（NADPMDH）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

NADP-MDH（EC1.1.1.82）是一种依赖NADP+的脱氢酶，主要功能包括：能量代谢调控：参与线粒体苹果酸-天冬氨酸穿梭，维持胞质与线粒体间NADH/NAD+平衡抗氧化防御：调节细胞内NADPH水平，为谷胱甘肽还原酶提供还原力，清除活性氧信号转导：参与激素信号响应、胁迫应激反应，与植物抗逆性密切相关临床应用：血清NADP-MDH活性异常与肝脏疾病、心肌损伤、糖尿病等相关

测定原理

NADP-MDH催化草酰乙酸还原为苹果酸，同时将NADPH氧化为NADP+，反应式如下： 草酰乙酸+NADPH+H+→NADP−MDH苹果酸+NADP+草酰乙酸+NADPH+H+NADP−MDH苹果酸+NADP+ NADPH在340nm处有特征吸收峰，通过监测340nm处吸光度的下降速率，计算NADP-MDH的酶活性。

自备仪器与试剂

必备仪器

紫外分光光度计（波长精度±1nm）或酶标仪（具备340nm检测通道）

台式高速离心机（最大转速≥12000g）

恒温水浴锅（控温精度±0.5℃）

可调式移液器（0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL）

超声破碎仪（用于细菌/细胞样本处理）

必备耗材

1mL石英比色皿（光径1cm）或96孔紫外板

离心管（1.5mL、10mL）

一次性吸头（无菌无酶）

研钵/组织匀浆器（冰浴专用）

自备试剂

蒸馏水/去离子水

生理盐水（用于样本稀释）

样本前处理方法

组织样本（动植物）新鲜样本取材后立即放入液氮速冻，-80℃保存；避免样本反复冻融称取0.05-0.1g组织，按1:5-10（W/V）比例加入预冷的提取液冰浴匀浆（转速1000-1500rpm，时间5-10min）转移至离心管，8000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测若酶活性过高，可用提取液稀释后测定（建议稀释倍数1-5倍）

细菌/细胞样本收集对数生长期细菌（OD600=0.6-0.8）或培养细胞（密度1×10^6/mL）8000g 4℃离心5min，弃上清，用生理盐水洗涤2次按500万细菌/细胞加入1mL提取液的比例重悬冰浴超声破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）12000g 4℃离心10min，取上清液置冰上待测

血清/血浆/尿液样本血清样本：血液凝固后3000g 4℃离心10min，取上清血浆样本：加入抗凝剂后3000g 4℃离心10min，取上清尿液样本：直接取上清，若浑浊需3000g离心5min后取上清以上样本可直接检测，无需提取处理

测定操作步骤

紫外分光光度法操作流程

试剂准备：

从-20℃取出试剂，室温平衡30min，避免阳光直射

试剂一：提取液，无需配制直接使用

试剂二：NADPH溶液，使用前用蒸馏水稀释10倍

试剂三：草酰乙酸溶液，使用前用NaOH溶液调节pH至7.5

空白管校正：

取1mL石英比色皿，依次加入：提取液970μL + 稀释后NADPH溶液10μL + 蒸馏水20μL

37℃预温育5min，记录340nm处初始吸光度A0

样本测定：

另取比色皿，依次加入：提取液950μL + 稀释后NADPH溶液10μL + 样本20μL

37℃预温育5min，加入草酰乙酸溶液20μL立即混匀

连续记录340nm处吸光度变化，分别读取0min（A1）和1min（A2）时的吸光度值

微量法（酶标仪）操作流程96孔板每孔加入：提取液95μL + 稀释后NADPH溶液1μL + 样本2μL37℃预温育5min，加入草酰乙酸溶液2μL立即混匀酶标仪设置动力学模式，340nm处连续读取10个循环（每6s读取1次）计算吸光度下降速率（ΔA/min）

酶活力计算方法

单位定义

U/mL：每mL样本每分钟氧化1nmol NADPH的酶量

U/mgprot：每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol NADPH的酶量

U/g鲜重：每g组织鲜重每分钟氧化1nmol NADPH的酶量

U/10⁴cell：每1万个细胞每分钟氧化1nmol NADPH的酶量

计算公式

NADP−MDH活性=ΔA×V反总×V样总ε×d×V样测×T×CNADP−MDH活性=ε×d×V样测×T×CΔA×V反总×V样总

ΔA：吸光度变化值（A1 - A2）

V反总：反应体系总体积（1.0mL）

V样总：样本提取液总体积（mL）

ε：NADPH摩尔消光系数（6.22×10³ L/(mol·cm)）

d：比色皿光径（1cm）

V样测：测定时加入的样本体积（0.02mL）

T：反应时间（1min）

C：样本浓度（蛋白浓度mg/mL、组织鲜重g/mL、细胞数10⁴/mL）

简化公式

血清/血浆样本：NADP-MDH（U/mL）= 6430 × ΔA

组织样本（蛋白浓度）：NADP-MDH（U/mgprot）= 6430 × ΔA ÷ Cpr

组织样本（鲜重）：NADP-MDH（U/g鲜重）= 6430 × ΔA ÷ W

细胞/细菌样本：NADP-MDH（U/10⁴cell）= 13 × ΔA

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免反复冻融；若无法立即检测，-80℃可保存1个月

组织匀浆需在冰浴中进行，避免酶失活

超声破碎时注意控制功率与时间，避免样本过热

试剂使用：

试剂二（NADPH）对光敏感，配制后需避光保存

试剂三（草酰乙酸）需现配现用，避免分解

不同批号试剂禁止混用，避免影响检测结果

测定过程：

若ΔA值大于0.5，建议将样本稀释后重新测定

反应温度需严格控制在37℃（哺乳动物样本）或25℃（植物样本）

测定前需用蒸馏水校正分光光度计零点

质量控制：

每次实验需设置空白对照与阳性对照

若结果偏差较大，需检查样本处理过程与试剂配制是否正确

公司正在出售的产品