NAD苹果酸脱氢酶（NADMDH）测试盒

商品属性

测定意义与原理

测定意义

MDH（EC1.1.1.37）广泛存在于各类生物细胞中，分为NAD依赖型和NADP依赖型：

线粒体NAD-MDH是三羧酸循环关键酶，催化苹果酸生成草酰乙酸，为能量代谢提供核心中间产物

胞质NAD-MDH参与苹果酸-天冬氨酸穿梭系统，调控胞质NADH进入线粒体氧化，对维持细胞能量稳态至关重要

酶活性变化可反映细胞能量代谢状态、活性氧水平及动植物抗病性

测定原理

NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降，通过监测吸光度下降速率计算酶活性。

自备仪器与试剂

仪器：紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、恒温水浴锅、可调式移液器、超声破碎仪（细菌/细胞样本）

耗材：1mL石英比色皿/96孔板、研钵/组织匀浆器、离心管、一次性吸头

试剂：蒸馏水

样本前处理方法

细菌/细胞样本

收集细菌或细胞至离心管，离心弃上清

按500万细菌/细胞加入1mL提取液的比例混合

冰浴超声破碎（功率20%/200W，超声3s，间隔10s，重复30次）

8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测

组织样本

称取约0.05-0.1g组织，按1:5-10比例加入提取液

冰浴匀浆处理

8000g 4℃离心10min，取上清置冰上待测

血清（浆）样本

直接取上清液检测，无需前处理

测定操作步骤

紫外分光光度法操作

分光光度计预热30min，调节波长至340nm，蒸馏水调零

试剂一37℃预热15min，按下表加样： | 试剂名称 | 测定管（μL） | 空白管（μL） |

| 试剂二 | 10 | 10 |

| 试剂三 | 10 | 10 |

| 样本/蒸馏水 | 20 | 20 |

充分混匀后立即记录340nm处初始吸光度A₁和反应1min后的吸光度A₂

计算ΔA = A₁ - A₂，分别记录测定管和空白管的ΔA值

酶活力计算方法

血清（浆）样本

单位定义：每mL血清（浆）每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位

NAD-MDH (U/mL) = 6430 × (ΔA测定 - ΔA空白)

组织样本（按蛋白浓度计算）

单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位

NAD-MDH (U/mgprot) = 6430 × (ΔA测定 - ΔA空白) ÷ Cpr

Cpr：样本蛋白质浓度（mg/mL）

组织样本（按鲜重计算）

单位定义：每g组织每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位

NAD-MDH (U/g鲜重) = 6430 × (ΔA测定 - ΔA空白) ÷ W

W：样本质量（g）

细菌/细胞样本

单位定义：每1万个细菌/细胞每分钟消耗1nmol NADH为1个活力单位

NAD-MDH (U/10⁴cell) = 13 × (ΔA测定 - ΔA空白)

注意事项

正式测定前建议选取2-3个预期差异大的样本做预实验

所有操作尽量在冰浴中进行，避免酶失活

若ΔA值大于0.5，建议将样本稀释后重新测定

试剂应按标签说明储存，不同批号试剂禁止混用

操作过程中使用一次性吸头，避免交叉污染

若初始吸光度小于0.7，建议增加样本量或减少稀释倍数

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