线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒 新品

线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶/三磷酸腺苷合酶测试盒

测定意义与原理

测定意义

线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶：临床诊断：诊断和监测线粒体疾病、神经退行性疾病、心血管疾病等疾病监测：评估细胞能量代谢状态、线粒体功能和治疗效果生物学研究：了解细胞代谢、细胞凋亡和细胞增殖机制环境监测：评估水体和土壤微生物污染程度食品检测：检测食品中微生物含量和新鲜度工业应用：优化生物发酵过程和生物技术生产工艺

测定原理

复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。反应式如下： ATP+H2O→线粒体复合体ⅤADP+PiATP+H2O线粒体复合体ⅤADP+Pi

试剂盒组成

微量法/比色法试剂盒

组分 规格 作用说明

试剂一 25mL×1瓶 含提取液，用于提取样本中的线粒体复合体Ⅴ

试剂二 25mL×1瓶 含提取液，用于线粒体提取

试剂三 1mL×1瓶 含提取液，用于线粒体提取

试剂四 粉剂×1支 含ATP溶液，反应底物，临用前加入1.3mL蒸馏水溶解，-20℃保存

试剂五 6mL×1瓶 含显色剂，用于检测无机磷（Pi）

试剂六 粉剂×1瓶 含还原剂，将磷钼酸还原成蓝色钼蓝，临用前加入3mL蒸馏水溶解，4℃保存一周

试剂八 粉剂×1瓶 含稳定剂，用于稳定蓝色钼蓝，临用前加入10mL蒸馏水溶解，4℃保存一周

定磷试剂 临用前配制 按H₂O:试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1的比例配制，用于检测无机磷（Pi）

标准品 1mL×1支 含磷标准品，用于建立标准曲线

ELISA法试剂盒

组分 规格 作用说明

包被板 96孔×1块 预包被抗线粒体复合体Ⅴ单克隆抗体

酶标抗体 液体6mL×1瓶 含HRP标记抗线粒体复合体Ⅴ抗体

标准品 液体1mL×6管 含0、2、4、8、16、32、64U/L线粒体复合体Ⅴ标准品

样本稀释液 10mL×1瓶 用于稀释样本和标准品

显色剂A液 6mL×1瓶 含过氧化氢溶液

显色剂B液 6mL×1瓶 含TMB溶液

终止液 6mL×1瓶 含硫酸溶液

20倍浓缩洗涤液 20mL×1瓶 用于洗涤酶标板

自备仪器与试剂

必备仪器

微量法/比色法：可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

ELISA法：酶标仪（450nm检测通道）、96孔板、37℃恒温箱、洗板机

通用：低温离心机（≥10000g）、恒温水浴锅、可调式移液器、电子天平

必备耗材

离心管（1.5mL/10mL）、一次性吸头、研钵/组织匀浆器

自备试剂：蒸馏水/去离子水、生理盐水

样本前处理方法

动植物组织样本取样：称取约0.1-0.2g组织，用生理盐水洗净表面杂质，用滤纸吸干匀浆：按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例进行冰浴匀浆离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测稀释：若线粒体复合体Ⅴ活性过高，用提取液稀释1-10倍后测定

细胞样本收集：收集1×10⁶细胞，加入1mL试剂一破碎：冰浴超声波破碎（功率20%，超声3s，间隔10s，重复30次）离心：10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测

血清/血浆样本

血清/血浆：直接测定；若浓度过高，用提取液稀释10-20倍

尿液：离心去除沉淀，取上清液测定；或用提取液稀释10-20倍

土壤样本取样：称取风干混匀土壤约0.1g提取：加400μl试剂一并且摇匀后，置于37℃恒温培养箱，开始计时，催化反应24h离心：8000g,25℃离心10min，取上清液置于冰上待测

测定操作步骤

微量法/比色法操作仪器预热：分光光度计预热30min以上，调节波长到660nm，用蒸馏水调零试剂配制：

试剂四：临用前每支加入1.3mL蒸馏水，充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存

试剂六：临用前加入3mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周

试剂八：临用前加入10mL蒸馏水，充分混匀；溶解后4℃保存一周

定磷试剂：按H₂O:试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1的比例配制标准曲线绘制：将磷标准品稀释成0、10、20、30、40、50μmol/L系列浓度，取100μL标准溶液于比色管中，加入100μL定磷试剂，混匀，室温反应15min，测定660nm吸光度，绘制标准曲线样品测定：

取100μL样本溶液，加入100μL试剂四，37℃水浴30min

加入100μL终止反应液，加入100μL定磷试剂，混匀，室温反应15min

测定660nm吸光度，根据标准曲线计算样本中无机磷（Pi）含量

根据无机磷（Pi）含量计算线粒体复合体Ⅴ活性

ELISA法操作试剂准备：将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡15-30分钟；将20×洗涤缓冲液用蒸馏水20倍稀释后备用加样：

从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min洗涤：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min终止：每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值结果计算：绘制标准曲线，按曲线方程计算样本浓度

结果计算方法

单位定义

U/mg prot：每毫克组织蛋白每分钟催化生成1μmol无机磷（Pi）的酶量

U/g 鲜重：每克鲜重样本每分钟催化生成1μmol无机磷（Pi）的酶量

U/L：每升样本每分钟催化生成1μmol无机磷（Pi）的酶量

微量法/比色法计算公式

线粒体复合体Ⅴ活性(U/mg prot)=(A测定−A空白)×C标×V总(A标准−A空白)×Cpr×W×T线粒体复合体Ⅴ活性(U/mg prot)=(A标准−A空白)×Cpr×W×T(A测定−A空白)×C标×V总

A测定：样本管吸光度值

A空白：空白管吸光度值

A标准：标准管吸光度值

C标：标准品浓度（μmol/mL）

V总：样本提取液总体积（mL）

Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

W：样本质量（g）

T：反应时间（min）

ELISA法计算公式

线粒体复合体Ⅴ含量(U/L)=样本OD值−空白OD值标准品OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数线粒体复合体Ⅴ含量(U/L)=标准品OD值−空白OD值样本OD值−空白OD值×标准品浓度×稀释倍数

性能指标

指标 微量法/比色法 ELISA法

线性范围 0~50μmol Pi/mL 0~64U/L

最低检测限 ≤0.1μmol Pi/mL ≤0.1U/L

回收率 90%~110% 90%~110%

批内精密度 CV≤5.0% CV≤10%

批间精密度 CV≤8.0% CV≤15%

稳定性 2-8℃保存6-12个月 2-8℃保存6个月

注意事项

样本处理：

样本需新鲜制备，避免线粒体复合体Ⅴ失活；-20℃可保存3个月

组织样本需冰浴匀浆，避免酶失活

液体样本需避免溶血和细菌污染

试剂使用：

试剂四、六、八需临用前配制，避免失效

ELISA法试剂需避免反复冻融，用后立即放回2-8℃保存

不同批号试剂不能混用，需重新绘制标准曲线

测定过程：

微量法/比色法反应温度需严格控制在37℃，反应时间30分钟

ELISA法需严格控制温育时间和温度，避免影响显色反应

若吸光度值超出线性范围，需稀释样本后重新测定

质量控制：

每次实验需设置空白对照和质控样本

定期校准仪器，确保检测结果准确性

若结果偏差较大，需检查试剂是否变质或样本处理是否正确

其他注意事项：

操作时需戴手套和口罩，避免接触皮肤和黏膜

所有试剂和样本需妥善处理，避免污染环境

试剂盒需在有效期内使用，过期试剂请勿使用

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