AATOM 594 马来酰亚胺 新品

溶液配制方案

除非另有说明，所有未使用的储备溶液应分成一次性等份，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。

1.AATOM 594 马来酰亚胺储备溶液（溶液 B） ：

将无水 DMSO 添加到 AATOM 594 马来酰亚胺小瓶中，制成 10 mM 储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。

注意     开始缀合前准备染料储备溶液（溶液 B）。及时使用。延长储存染料原液可能会降低染料活性。避光防潮时，溶液 B 可在冰箱中保存长达 4 周。避免冻融循环。

2. 蛋白原液（A液）

将 100 μL 反应缓冲液（例如，pH ~6.0 的 100 mM MES 缓冲液）与 900 μL 目标蛋白溶液（例如抗体，蛋白浓度 > 2 mg/mL 如果可能）混合，得到 1 mL 蛋白标记库存溶液。

注1：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 应为 6.5 ± 0.5。

注2：不纯的抗体、稳定的牛血清蛋白（BSA）抗体或明胶不会被很好的标记。叠氮化钠或硫柳汞的存在也可能干扰缀合反应。可以通过透析或旋转柱除去叠氮化钠或硫柳汞，以获得标记结果。

注3：如果蛋白质浓度低于 2 mg/mL，结合效率会显着降低。为了获得最佳标记效率，建议最终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

可选：如果您的蛋白质不含游离半胱氨酸，则必须用 DTT 或 TCEP 处理蛋白质以生成硫醇基团。 DTT 或 TCEP 用于将二硫键转化为两个游离硫醇基团。如果使用 DTT，则必须在将马来酰亚胺染料与蛋白质结合之前通过透析或凝胶过滤除去游离 DTT。以下是生成游离硫醇基团的示例方案：

1.在蒸馏水中制备 1 M DTT (15.4 mg/100 µL) 的新鲜溶液。

2.在 20 mM DTT 中制备 IgG 溶液：混合时每 ml IgG 溶液添加 20 µL DTT 库存。在室温下静置 30 分钟，无需额外混合（以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸）。

3.将还原的 IgG 通过用“交换缓冲液”预平衡的过滤柱。从柱中收集 0.25 mL 馏分。

4.确定蛋白质浓度并将大部分 IgG 的级分合并。这可以通过分光光度法或比色法来完成。

5.此步骤后尽快进行缀合（请参阅示例实验方案）。

注意：为了获得最佳结果，IgG 溶液应 >4 mg/mL。如果抗体低于 2 mg/mL，则应浓缩。额外包括 10% 的缓冲液交换柱损失。

注意：几乎可以在 pH 7-7.5 的任何缓冲液中进行还原，例如 MES、磷酸盐或 TRIS 缓冲液。

注意：步骤 3 和 4 可以用透析代替。