赤霉菌探针法荧光定量PCR试剂盒 新品

赤霉菌探针法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

检验原理

本试剂盒基于探针法荧光定量PCR技术，针对赤霉菌（Gibberella fujikuroi）高度保守基因区域设计特异性引物及探针，通过实时监测荧光信号实现核酸的定性与定量检测。

灵敏度：最低检测限达100拷贝/反应。

特异性：不与相近微生物DNA发生交叉反应。

线性范围：定量检测时覆盖5个数量级（10^1–10^6拷贝/μL）。

对照设置：提供无传染性DNA片段作为阳性对照，便于区分假阴性。

适用仪器

兼容主流荧光定量PCR仪，包括：

ABI系列（如7500、StepOnePlus）

安捷伦（MX3000P/3005P）

Roche LightCycler

Bio-Rad（CFX系列）

Eppendorf Mastercycler ep realplex

自备试剂与耗材

样本DNA：需用户自行提取（推荐柱式提取试剂盒或免提取核酸释放剂）。

耗材：无菌带滤芯枪头、PCR管、离心管、冰盒等。

操作步骤

1. 标准曲线制备（独立区域操作）

标记6管（6–1号），依次加入45 μL专用稀释液。

从阳性对照（10^7拷贝/μL）开始，10倍梯度稀释至10^1拷贝/μL（每步换枪头，冰上保存）。

2. 样本处理

设置N+2个提取（含阳性对照PC和阴性对照NC）。

PC：阳性对照稀释液（10^4拷贝/μL）模拟样本体积；NC：超纯水。

3. qPCR反应体系（20μL/管）

| 成分 | 样品管 | 阴性对照 | 标准曲线管 |

| qPCR缓冲液 | 10 μL | 10 μL | 10 μL |

| 酶混合液 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |

| 探针引物混合液 | 3 μL | 3 μL | 3 μL |

| 模板DNA | 5 μL | — | — |

| 标准曲线稀释液 | — | — | 5 μL |

| 超纯水（补足体积） | — | 5 μL | — |

4. 反应程序

预变性：95℃ 10 min

循环（40次）：95℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM通道信号）

结果判读

定量分析：以阳性对照log浓度为横轴、Ct值为纵轴绘制标准曲线，计算样本浓度。

定性分析：

阳性：Ct≤36，且溶解曲线Tm值与对照一致。

阴性：Ct≥40。

可疑值（36<Ct<40）：需重复检测。

注意事项

分区操作：试剂配制、样本处理、扩增需在不同区域进行，避免交叉污染。

质量控制：

阴性对照无Ct值，阳性对照Ct≤36。

若阴性对照出现扩增，提示污染，实验无效。

局限性：

基因突变可能导致假阴性；

提取效率差异或运输不当可能影响结果准确性。

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