皂角刺探针法PCR鉴定试剂盒

检测原理

基于实时荧光定量PCR（qPCR）技术，采用探针法（TaqMan原理）：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团（如NFQ）。

信号释放：PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性切割探针，使报告基团与淬灭基团分离，释放荧光信号。

定量分析：通过监测荧光强度增长（Ct值）实现靶序列的定性和定量检测。

产品组成

| 成分 | 规格 | 功能 |

| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |

| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 50-100μL | 含逆转录酶、Taq酶等 |

| 荧光PCR模板稀释液 | 1mL | 标准品稀释及阴性对照 |

| 皂角刺特异性引物-探针混合液 | 100μL | 靶序列扩增与检测 |

| 阳性对照（1×10^7-10^8拷贝/μL） | 50μL | 标准曲线制备 |

| 说明书 | 1份 | 操作指南 |

操作步骤

1. 标准曲线制备（以10倍梯度稀释为例）：

取阳性对照（10^7拷贝/μL）依次稀释至10^1-10^6拷贝/μL，分装至标记离心管，冰上保存。

2. 样品制备：

RNA提取：使用兼容的RNA提取试剂盒，建议设置阴性（NC）和阳性对照（PC）。

DNA提取（若检测DNA）：需避免交叉污染。

3. qPCR反应体系（20μL）：

| 成分 | 体积 |

| qRT-PCR缓冲液 | 10μL |

| 酶混合液 | 2μL |

| 引物-探针混合液 | 2μL |

| 样品RNA/DNA | 5μL |

| 超纯水 | 补至20μL |

4. 反应程序：

逆转录：50℃ 10-30 min（RNA需此步骤）。

预变性：94℃ 10 min。

扩增（40循环）：94℃ 15 sec → 60℃ 60 sec（采集FAM通道信号）。

数据分析

定量检测：以标准曲线log值为横轴、Ct值为纵轴，计算样品浓度。

定性检测：

阳性：Ct ≤ 35（或39），扩增曲线呈S型。

阴性：Ct ≥ 40，或无扩增。

可疑结果（35-40）：需重复检测。

注意事项

分区操作：样品处理、试剂配制、扩增需在不同区域进行，避免污染。

质量控制：每次实验需包含阴/阳性对照。

探针保护：避光保存，避免反复冻融。

生物安全：实验废弃物需按生物危害物处理（如10%次氯酸消毒）。

局限性

检测结果受样本质量、提取效率、运输条件影响。

基因突变可能导致假阴性；交叉污染可能导致假阳性。

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