紫苏叶探针法PCR鉴定试剂盒

检测原理

基于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，采用特异性探针法：

探针设计：5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团，探针与靶序列结合后，Taq酶的5'→3'外切酶活性切割探针，释放荧光信号。

定量分析：通过监测荧光信号增长（Ct值）与标准曲线比对，实现靶RNA的定性和定量检测。

试剂盒组成

| 成分 | 规格 | 功能 |

| 探针法qRT-PCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |

| 探针法qRT-PCR酶混合液 | 100μL | 含逆转录酶、Taq酶等 |

| 荧光PCR专用模板稀释液 | 1 mL | 标准品稀释及阴性对照 |

| 紫苏叶引物-探针混合液 | 100μL | 特异性扩增靶序列 |

| 紫苏叶qRT-PCR探针 | 50μL | 荧光标记探针 |

| 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） | 50μL | 标准曲线制备 |

| 说明书 | 1份 | 操作指南 |

实验步骤

1. 标准曲线制备（6个梯度稀释，10²~10⁷拷贝/μL）

使用阳性对照按10倍梯度稀释，避免交叉污染。

2. RNA提取

建议设置阴性对照（NC）和阳性对照（PC），推荐使用柱式RNA提取试剂。

3. qRT-PCR反应体系（20μL）

| 成分 | 体积 |

| qRT-PCR缓冲液 | 10μL |

| 酶混合液 | 2μL |

| 引物-探针混合液 | 2μL |

| 探针 | 1μL |

| RNA模板 | 5μL |

4. 反应程序

| 步骤 | 温度 | 时间 |

| 逆转录 | 50℃ | 30 min |

| 预变性 | 94℃ | 10 min |

| PCR扩增（40循环） | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集FAM信号） |

数据分析

定量检测：以标准曲线log值为横轴、Ct值为纵轴，计算样本浓度。

定性检测：

阳性：Ct ≤ 35，扩增曲线呈S型；

可疑：35 < Ct < 40，需复测；

阴性：Ct ≥ 40或无扩增。

注意事项

分区操作：样本处理、试剂配制、扩增需在不同区域进行，避免污染。

质量控制：阴性对照Ct应≥40，阳性对照Ct≤30。

重复性：可疑结果需重复检测。

局限性：

基因突变可能导致假阴性；

交叉污染可能导致假阳性。

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