侧孢短芽孢杆菌探针法qPCR试剂盒

检测原理

基于实时荧光定量PCR技术（探针法），通过Taq酶的5'→3'外切酶活性切割探针，释放荧光报告基团（如FAM），实现靶序列的定量检测。探针5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团，扩增过程中荧光信号与产物积累呈正比，通过标准曲线计算模板浓度。

试剂盒组成

| 成分 | 规格 | 功能 |

| qPCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |

| qPCR酶混合液 | 100μL | 含逆转录酶、Taq酶等 |

| 探针及引物混合液 | 各50-100μL | 特异性识别靶序列 |

| 阳性对照（无传染性DNA片段） | 50μL（1×10⁸拷贝/μL） | 标准曲线制备 |

| 模板稀释液 | 1mL | 标准品梯度稀释 |

| 说明书 | 1份 | 操作指南 |

操作步骤

1. 标准曲线制备

将阳性对照按10倍梯度稀释（10⁷~10²拷贝/μL），每个梯度独立操作以避免污染。

2. 样本处理

RNA提取：推荐使用柱式提取法，避免抑制剂残留。

阴性/阳性对照设置：每批次检测需包含无模板对照（NTC）及阳性对照。

3. qPCR反应体系（20μL）

| 组分 | 体积（μL） |

| 缓冲液 | 10 |

| 酶混合液 | 2 |

| 探针 | 1 |

| 引物混合液 | 2 |

| 模板 | 5 |

4. 扩增程序

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |

| 逆转录 | 50℃ | 30 min | 1 |

| 预变性 | 94℃ | 10 min | 1 |

| 扩增 | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集荧光） | 40 |

结果分析

定量检测：以标准曲线log值为横轴、Ct值为纵轴，计算样本浓度。

定性检测：

阳性：Ct≤36，典型扩增曲线；

阴性：Ct≥40；

可疑值（36<Ct<40）：需复测确认。

注意事项

分区操作：样本处理、试剂配制、扩增需在独立区域进行，防止交叉污染。

质量控制：每批检测需包含阴/阳性对照，异常结果需复核。

保存与运输：-20℃避光保存，低温运输，避免反复冻融（≤7次）。

适用范围：仅限科研使用，不可用于临床诊断。

局限性

检测结果受样本质量、提取效率及操作规范影响。

高浓度模板可能抑制反应，建议稀释后复测。

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