小鼠微小病毒探针法荧光定量PCR试剂盒

检测原理

基于TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术：

探针设计：针对MVM病毒高度保守区域设计特异性引物及探针，5'端标记荧光报告基团（如FAM），3'端标记淬灭基团。

信号释放：PCR扩增时，Taq酶切割探针，分离报告基团与淬灭基团，释放荧光信号，通过实时监测荧光强度实现定量分析。

定量/定性分析：通过标准曲线计算模板拷贝数（定量），或根据Ct值判定阴阳性（定性）。

试剂盒组成

| 成分 | 规格 | 功能 |

| qPCR缓冲液 | 500μL | 提供反应体系基础环境 |

| 酶混合液 | 100μL | 含逆转录酶（若需）、Taq DNA聚合酶 |

| 探针及引物混合液 | 各50-100μL | 特异性扩增MVM靶序列 |

| 阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） | 50μL | 标准曲线制作及质控 |

| 阴性对照（无核酸酶水） | 50μL | 污染监测 |

| 模板稀释液 | 1mL | 标准品梯度稀释 |

操作步骤

1. 样本前处理

DNA/RNA提取：推荐使用商业化提取试剂盒，避免交叉污染。提取后模板保存于-20℃（短期）或-70℃（长期）。

2. 标准曲线制备（定量检测需选）

将阳性对照按10倍梯度稀释（10²~10⁷拷贝/μL），每个梯度独立操作，避免污染。

3. PCR反应体系配制

20μL体系：

缓冲液 10μL

酶混合液 2μL

探针1μL + 引物混合液2μL

模板DNA/RNA 5μL

4. 扩增程序

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |

| 逆转录（若需） | 50℃ | 30 min | 1 |

| 预变性 | 94℃ | 10 min | 1 |

| 扩增 | 94℃ 15 sec → 60℃ 1 min（采集荧光） | 40 |

结果判读

定量分析：以标准曲线log值为横轴、Ct值为纵轴，计算样本拷贝数。

定性分析：

阳性：Ct值<35，S型扩增曲线。

可疑：Ct值35-38，需复检。

阴性：Ct值≥38或无扩增。

注意事项

分区操作：样本处理、试剂配制、扩增需在独立区域进行，避免污染。

质控要求：每批次实验需包含阴/阳性对照。

仪器兼容性：适用于ABI、Bio-Rad、LightCycler等主流荧光PCR仪。

用途限制：仅限科研使用，不可用于临床诊断。

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