大豆拟茎点种腐病菌探针法荧光定量PCR试剂盒 新品

产品用途

科研实验，用于大豆拟茎点种腐病菌核酸的定性及定量检测。

保存条件：-20℃±5℃避光保存，避免反复冻融（≤7次），有效期12个月。

检测原理

采用TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术，针对Phomopsis longicolla基因保守区域设计特异性引物及探针。通过荧光信号累积实时监测扩增过程，结合标准曲线实现核酸的定性与定量分析。

试剂盒组成

扩增液：含预混PCR反应缓冲液、dNTPs、酶等。

反应液：含荧光探针、引物。

阳性质控品：人工合成靶基因片段（1×10^8拷贝/μL）。

阴性质控品：无核酸酶水。

说明书：1份。

操作步骤

样本DNA制备

使用兼容的核酸提取试剂盒提取样本DNA，建议设置阴性/阳性对照（N+2管）。

提取的DNA建议-15℃以下保存，避免降解。

标准曲线制备（定量检测需选做）

标记6管，依次加入45μL稀释液，梯度稀释阳性质控品（10^8~10^3拷贝/μL）。

每稀释步骤需更换枪头，充分震荡混匀后冰上保存。

PCR反应体系配制（20μL体系）

按N+9管（样本+对照+标准曲线）计算需配制反应液（19.5μL反应液+0.5μL扩增液/管）。

分装后加入2μL模板（样本/对照），离心混匀。

扩增程序

上机设置：

预变性：95℃ 2分钟

扩增循环：95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟（40循环）

荧光信号采集于60℃延伸阶段。

适用仪器：ABI、Bio-Rad、LightCycler等主流荧光定量PCR仪。

结果判读

定量分析：以阳性对照log浓度为横轴、Ct值为纵轴绘制标准曲线，计算样本浓度。

定性分析：

阳性：Ct≤35，扩增曲线呈S型；

阴性：Ct≥40或无Ct值；

可疑（35<Ct<40）：需复测确认。

注意事项

分区操作：样本处理、试剂配制、扩增需在独立区域进行，避免交叉污染。

防污染措施：使用滤芯吸头、一次性手套，实验后以10%次氯酸或75%乙醇清洁台面。

试剂处理：使用前充分融化混匀，避免反复冻融；反应液避光保存。

质量控制：阴性对照Ct应≥40，阳性对照Ct≤30且曲线典型。

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