假单胞菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒

假单胞菌属通用染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

产品概述

绿脓假单胞菌又称铜绿假单胞菌，是一种常见的条件致病菌，可引起呼吸道、泌尿道、烧伤创面等多种感染，尤其在医院获得性感染中占比极高。本试剂盒基于SYBR Green I染料法荧光定量PCR技术开发，可快速、精准地检测样本中的绿脓假单胞菌DNA，适用于临床诊断、医院感染监测、食品卫生检测及科研实验等场景。

产品核心特点

操作便捷：即开即用，用户仅需提供样品DNA模板，无需额外配制复杂试剂

高特异性：引物针对绿脓假单胞菌高度保守基因序列设计，与其他细菌及人体基因组无交叉反应

高灵敏度：最低检测限低至100拷贝/反应，可精准识别低感染量样本

双模式检测：既可用于定性检测（判断阴阳性），又可用于定量检测（分析菌载量），定量线性范围达5个数量级（10²-10⁷拷贝/μL）

防污染设计：采用一管式闭管操作，避免PCR产物污染；不提供活体阳性对照，仅使用无传染性的DNA片段，降低生物安全风险

通量充足：单盒可完成50次20μL体系的荧光定量PCR反应

安全可靠：本产品仅用于科研，不能用于临床诊断

标准规格与成分

成分 规格 用途说明

2×qPCR MagicMix 2.5mL 包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²+、SYBR Green I染料等PCR核心反应体系

荧光PCR专用模板稀释液 1mL 用于稀释阳性对照和样品模板

绿脓假单胞菌PCR引物混合液 100μL 针对保守基因区域设计的特异性扩增引物

阳性对照（1×10⁸拷贝/μL） 50μL 无传染性DNA片段，用于验证PCR反应体系有效性

DNA抽提液（试用装） 9mL 快速裂解细菌释放DNA，免费提供15次用量

使用手册 1份 详细操作指南与问题解决方案

操作流程

一、样品采集与预处理

食品样品：按照细菌检验要求进行采集与预培养

血液样品：用无菌注射器抽取受检者血2mL，注入无菌EDTA-2Na（或柠檬酸钠）抗凝管，立即混匀

粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检

病灶部位样品：取部位新鲜渗出物、粘液脓血送检

二、样品DNA制备

液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应

固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应

粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应

其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应

三、阳性对照梯度稀释（用于绘制标准曲线）

注意事项：阳性对照浓度极高，需在独立区域操作，避免污染其他试剂和样品

标记离心管：标记6个离心管，编号为7、6、5、4、3、2

加入稀释液：每管加入45μL荧光PCR专用模板稀释液

梯度稀释：

向7号管加入5μL原始阳性对照，震荡1分钟，得到1×10⁷拷贝/μL的稀释液

换枪头，取5μL 7号管稀释液加入6号管，震荡1分钟，得到1×10⁶拷贝/μL的稀释液

按上述方法依次稀释至2号管，最终得到10²-10⁷拷贝/μL的6个梯度浓度，置于冰上备用

四、qPCR反应体系配置（20μL体系）

组分 样品管 阴性对照 阳性对照

2×qPCR MagicMix 10μL 10μL 10μL

绿脓假单胞菌PCR引物混合液 2μL 2μL 2μL

自备10×ROX 2μL 2μL 2μL

样品DNA模板 6μL - -

灭菌双蒸水 - 6μL -

阳性对照稀释液 - - 6μL

注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4等）不需要使用ROX，则用水替代

五、PCR扩增程序设置

预变性：95℃ 5分钟

PCR循环（40次）：

变性：94℃ 15秒

退火延伸：58℃ 60秒（同时采集荧光信号）

熔解曲线分析：60℃-95℃，每升温0.5℃保持1秒并采集荧光信号

数据采集与处理

数据采集

具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

定性检测

阴性对照：Ct值≥40或无扩增曲线

阳性对照：Ct值≤30，有典型S型扩增曲线

样品检测：

Ct值≤35：阳性（存在绿脓假单胞菌）

35<Ct<40：需重复实验，重复后Ct<40判为阳性，Ct≥40判为阴性

Ct值≥40：阴性（未检测到绿脓假单胞菌）

定量检测

以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴绘制标准曲线

根据样品Ct值从标准曲线计算对应菌载量，计算公式：

菌载量（拷贝/μL）= 10^[(A-B)/C]

（A为截距，B为样品Ct值，C为斜率）

定量线性范围：10²-10⁷拷贝/μL

运输与保存要求

运输条件：采用泡沫箱加冰密封运输，低温冷链配送

保存条件：-20℃避光保存，有效期12个月；阳性对照需单独存放，避免污染其他试剂

注意事项：试剂避免反复冻融，使用前需充分混匀并短暂离心

注意事项

生物安全防护：实验操作需在生物安全柜中进行，穿戴实验服、手套、口罩，避免直接接触样本

交叉污染防控：实验区域分为试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区，各区器材独立使用；使用带滤芯吸头，实验结束后用75%酒精或紫外灯消毒工作台

操作规范：严格按照说明书操作，试剂使用前自然融化并充分混匀；反应液需避光保存，避免荧光信号丢失

对照设置：每次实验必须设置阴阳性对照，以验证实验体系有效性

废弃物处理：实验废弃物需经高压灭菌处理后丢弃

数据判断：通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析

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