马疱疹病毒4型染料法荧光定量PCR试剂盒

马疱疹病毒4型染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

产品基本信息

| 项目 | 内容 |

| 检测方法 | 实时荧光定量PCR（SYBR Green I染料法） |

| 靶基因区域 | EHV-4 gB基因保守区 |

| 检测样本类型 | 马鼻拭子、全血（EDTA抗凝）、流产组织、脑脊液 |

| 储存条件 | -20℃避光保存（有效期12个月） |

| 适用仪器 | ABI 7500, Bio-Rad CFX96, Roche LightCycler 480等主流qPCR仪 |

检测原理

采用SYBR Green I荧光染料技术，特异性扩增EHV-4的gB基因片段。通过实时监测荧光信号强度，结合标准曲线对病毒核酸进行绝对定量分析（copies/μL），灵敏度可达10 copies/μL。

试剂盒组分（50测试）

| 组分名称 | 体积/数量 | 主要成分 |

| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 1.25 mL | HotStart Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I染料、稳定剂 |

| EHV-4特异性引物混合液 | 200 μL | 上游引物：5'-CGGACAAACCGTCCTACTC-3'
下游引物：5'-GTAGTCGTCGGTGTCGTTGT-3' |

| EHV-4阳性对照（PC） | 100 μL | 含gB基因重组质粒（10⁶ copies/μL） |

| 无核酸酶水（NFW） | 1 mL | RNase/DNase-free水 |

| NTC阴性对照 | 100 μL | TE缓冲液 |

操作流程

1. 样本前处理

鼻拭子/组织样本：使用病毒DNA提取试剂盒（推荐柱提法）提取核酸

全血样本：需先进行红细胞裂解，再提取白细胞DNA

2. PCR反应体系配制（20 μL体系）

| 组分 | 体积（μL） |

| 2× Master Mix | 10 |

| 引物混合液 | 2 |

| 模板DNA | 5 |

| NFW | 3 |

对照设置：每批实验需包含阳性对照（PC） 和无模板对照（NTC）

3. 扩增程序设置

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 关闭 |

| 变性 | 95℃ | 15 sec | | 关闭 |

| 退火 | 60℃ | 30 sec | 40 | 开启 |

| 延伸 | 72℃ | 10 sec | | 关闭 |

| 熔解曲线 | 65℃→95℃ | 0.5℃/sec | 1 | 开启 |

结果判读标准

阳性：

Ct值 ≤ 35.0

熔解曲线单峰（Tm = 85.0±0.5℃）

可疑：

35.0 < Ct值 ≤ 38.0 → 建议重复检测

阴性：

Ct值 > 38.0 或无扩增曲线

NTC无扩增，PC Ct值在预期范围内（20-25）

定量分析：使用标准品梯度稀释（10¹~10⁸ copies/μL）建立标准曲线，R² ≥ 0.99

性能指标

| 参数 | 性能 |

| 灵敏度 | 10 copies/μL |

| 特异性 | 不与EHV-1、EIV、EAV交叉反应 |

| 重复性 | CV < 5%（n=10） |

| 检测限（LoD）| 50 copies/mL样本 |

注意事项

生物安全：

疑似感染样本需在BSL-2实验室处理

废弃反应管需用10%次氯酸钠浸泡后高压灭菌

防污染措施：

核酸提取区、PCR配制区、扩增区严格分区

使用带滤芯吸头及UV灭菌工作台

质量控制：

若NTC出现扩增，本次实验无效

阳性对照Ct值偏移>2.0需排查原因

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