猪腺病毒染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

猪腺病毒染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

产品概述

本试剂盒采用优化的SYBR Green I染料法实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）技术，用于特异性检测猪样本（如粪便、肠道内容物、组织匀浆液、细胞培养物等）中的猪腺病毒（Porcine Adenovirus, PAdV）核酸（DNA）。

原理

试剂盒包含针对PAdV高度保守区域设计的特异性引物。在PCR扩增过程中，SYBR Green I染料特异性地嵌入新合成的双链DNA（dsDNA）中，在激发光下发出荧光信号。荧光信号的强度与反应体系中产生的dsDNA量成正比，通过实时监测荧光强度的变化，即可实现对起始模板DNA的定量分析。

产品特点

高特异性： 优化的引物设计确保对猪腺病毒的特异性扩增。

高灵敏度： 可检测低拷贝数的病毒核酸。

快速高效： 配合快速PCR程序，可在约1.5-2小时内完成检测。

定量准确： 标准曲线法可实现病毒载量的准确定量。

操作简便： 预混Master Mix形式，减少操作步骤，降低污染风险。

用途： 适用于猪腺病毒感染的临床诊断、流行病学调查、病毒载量监测、疫苗效力评估及科学研究等。

试剂盒组分

| 组分名称 | 规格 (48 tests) | 规格 (96 tests) | 储存条件 |

| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 600 μL × 1 管 | 1200 μL × 1 管 | -20℃ |

| 包含： 热启动DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、优化Buffer、SYBR Green I染料、稳定剂等。 | | | |

| PAdV qPCR Primer Mix (F+R) | 60 μL × 1 管 | 120 μL × 1 管 | -20℃ |

| 包含： 针对PAdV的特异性正向引物（Forward Primer）和反向引物（Reverse Primer），工作浓度。 | | | |

| Nuclease-Free Water | 1 mL × 1 管 | 1 mL × 1 管 | 室温/-20℃ |

| PAdV Positive Control (PC) | 50 μL × 1 管 | 50 μL × 1 管 | -20℃ |

| 包含： 已知拷贝数的PAdV特异性靶片段（如克隆质粒或体外转录RNA/DNA）。 | | | |

| Negative Control (NC) | 50 μL × 1 管 | 50 μL × 1 管 | -20℃ |

| 通常为： Nuclease-Free Water或确认无PAdV的猪样本核酸提取液。 | | | |

| 说明书 | 1 份 | 1 份 | 室温 |

样本要求

样本类型： 猪粪便拭子/内容物、肠道组织、淋巴结、肺、脾、细胞培养上清/裂解物等。

样本处理： 严格按照核酸提取试剂盒说明书操作，提取样本中的总DNA。提取的DNA应置于冰上或-20℃/-80℃保存备用。建议提取后尽快进行qPCR检测。

核酸纯度与浓度： 提取的DNA应无明显降解，A260/A280比值在1.7-1.9之间为佳。避免使用含有高浓度抑制剂（如血红素、胆盐、腐殖酸等）的模板。建议使用前对提取的样本DNA进行适当稀释（如1:10），以降低潜在抑制剂的影响。

检测程序

实验前准备：

从-20℃冰箱取出试剂盒（除Nuclease-Free Water外），置于冰上融化。避免反复冻融！ 使用前需轻轻混匀各组分，短暂离心使液体沉至管底。

准备好自备材料、仪器及实验区域。移液器、工作台面等需进行消毒。

根据待检测样本数量（包括样本、阳性对照PC、阴性对照NC），提前标记好PCR管或PCR板孔。

强烈建议在独立区域（最好是不同的房间或超净台）配制反应混合液，与加样区域分开。

反应混合液配制（以单反应20μL体系为例，建议配制混合液时预留10%的富余量）：

在洁净的离心管中，按以下比例配制反应混合液（Master Mix）。根据总反应数（n）计算所需各组分体积：

| 组分 | 单反应体积 (μL) | n个反应体积 (μL) |

| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 10.0 | 10.0 × (n+1) |

| PAdV qPCR Primer Mix (F+R) | 0.8 | 0.8 × (n+1) |

| Nuclease-Free Water | 7.2 | 7.2 × (n+1) |

| 总体积 | 18.0 | 18.0 × (n+1) |

涡旋振荡或轻轻吹打混匀混合液，短暂离心。

加样：

将18.0 μL混合液分装至预先标记好的PCR管/板孔中。

分别加入2.0 μL以下模板：

待测样本DNA

PAdV Positive Control (PC)

Negative Control (NC)

盖紧管盖或封好板膜，短暂离心使液体沉至管底/孔底，避免气泡。

PCR扩增程序设置：

将反应管/板放入荧光定量PCR仪中，设置以下循环程序（以ABI 7500为例，具体可根据仪器和引物特性优化）：

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 | 说明 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 不采集 | 激活热启动酶，DNA变性 |

| PCR扩增 | 95℃ | 15 sec | 40-45 | 不采集 | 变性 |

| | 60℃ | 30 sec | | 采集 (SYBR) | 退火/延伸 & 荧光采集 |

| 熔解曲线分析 | 95℃ | 15 sec | 1 | 不采集 | |

| | 60℃ | 1 min | | 不采集 | |

| | 95℃ | 15 sec | | 连续采集 | 熔解曲线 (SYBR) |

| | 60℃ | 15 sec | | | |

退火/延伸温度（60℃） 是引物特异性的关键，请根据实际引物Tm值优化（通常在55-65℃之间）。

荧光采集通道： 选择SYBR Green/FAM通道（通常为FAM/SYBR通道）。

熔解曲线分析： 是SYBR Green法区分特异性产物与非特异性产物（如引物二聚体）的关键步骤。设置从高于Tm值（如60℃）缓慢升温到95℃，并连续采集荧光信号。

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