牛血吸虫染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

产品特点

即开即用：用户只需提供病毒样品，操作简便

特异性强：根据牛血吸虫保守序列设计专一性引物，与其他病原体无交叉反应

灵敏度高：检测下限可达几百拷贝/反应

防污染设计：一管式荧光定量PCR检测，避免后续污染

双重功能：可同时用于定性检测和定量检测，定量时线性范围至少5个数量级

试剂盒组成

组分 规格 说明

2×qPCR Magic Mix 棕色管 含染料、Taq酶、dNTPs等

荧光PCR专用模板稀释液 1mL（黄盖） 用于稀释阳性对照和样品

牛血吸虫染料法PCR引物混合液 白盖 特异性扩增引物

牛血吸虫染料法PCR阳性对照 50μL（红盖） 1×10⁸拷贝/μL DNA片段

DNA病毒裂解液（试用装） 15次（9mL） 用于样品前处理

使用手册 1份 详细操作说明

实验步骤

一、稀释PCR阳性对照（以10²-10⁷拷贝/μL 6个稀释度为例）

标记6个离心管，编号为7、6、5、4、3、2

每个离心管加入45μL荧光PCR专用模板稀释液

在7号管加入5μL 1×10⁸拷贝/μL阳性对照，充分震荡1分钟，得到1×10⁷拷贝/μL稀释液

换枪头，取5μL 7号管溶液加入6号管，震荡1分钟，得到1×10⁶拷贝/μL稀释液

依次类推，得到1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝/μL共6个稀释度

所有稀释液放冰上待用

二、样品DNA制备

若有N个样品，需设置N+2个提取：N个样品+1个样品制备阳性对照(PC)+1个样品制备阴性对照(NC)

PC制备：取10μL 1×10⁴或1×10⁵拷贝/μL阳性对照，加水至与样品体积一致

NC制备：用无菌水替代样品

用自选方法纯化样品DNA，试剂盒兼容大多数核酸提取试剂盒

三、设置qPCR反应（20μL体系）

标记PCR管：

定量分析：N+9个管（N+2个样品+1个PCR阴性对照+6个阳性对照）

定性分析：N+4个管（N+2个样品+1个PCR阴性对照+1个阳性对照）

按以下体系配制反应液： | 组分 | 样品管 | PCR阴性对照 | PCR阳性对照 |

 | 2×qPCR Magic Mix | 10μL | 10μL | 10μL | | 牛血吸虫PCR引物混合液 | 2μL | 2μL | 2μL | | 模板 | 2μL样品DNA | 2μL无菌水 | 2μL对应稀释度阳性对照 | | 无菌水 | 6μL | 6μL | 6μL |

仅ABI 7500/7700/7900仪器需添加ROX作为参照，其他仪器用水替代

四、PCR扩增反应

将PCR管放入荧光定量PCR仪，设置以下程序：

预变性：95℃ 10分钟

扩增循环（40个循环）：95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟（采集荧光信号）

具体参数可根据仪器型号优化调整

结果分析

定量分析

以阳性对照浓度的log值为横轴，Ct值为纵轴绘制标准曲线

根据样品Ct值从标准曲线推算样品DNA浓度

定性分析

阴性对照：Ct值≥40，无明显扩增曲线

阳性对照：Ct值≤30，有典型S型扩增曲线

样品判定：

Ct值≤38，有明显扩增曲线 → 阳性

Ct值≥40或无Ct值 → 阴性

38<Ct值<40 → 需复检，复检结果仍在此范围且有扩增曲线则判为阳性

注意事项

所有操作严格按照说明书进行，试剂使用前自然融化并充分混匀

阳性对照浓度极高，稀释操作需在独立区域进行，避免污染

实验分区进行：样品处理区、试剂准备区、核酸扩增区

使用一次性吸头、手套和专用工作服，避免交叉污染

反应液应避光保存，避免气泡产生，管盖需盖紧

实验完毕后用10%次氯酸、75%酒精或紫外灯处理工作台

不同批号试剂不可混用，试剂应在有效期内使用

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