梭形血吸虫染料法荧光定量PCR试剂盒

检测原理

采用 SYBR Green I 荧光染料法，靶向扩增梭形血吸虫线粒体细胞色素b基因（mt-cytb）保守区域（123 bp），通过熔解曲线分析（Tm值：82.0±0.5℃）实现高特异性检测。

应用场景

疫区水源及中间宿主钉螺的病原监测

患者血清/粪便样本的早期感染诊断

药物治疗效果动态评估

试剂盒组分

| 组分名称 | 50T规格 | 保存条件 |

| 2× SYBR Green qPCR MasterMix | 625 μL | -20℃ |

| S. mansoni PCR引物混合液（10 μM） | 100 μL | -20℃ |

| 阳性对照（重组质粒，10^4 copies/μL） | 50 μL | -20℃ |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | 室温 |

| RNase-Free Water | 1 mL | 室温 |

引物序列（根据NCBI GenBank: AF247163.1设计）

上游引物：5'-CCT GTT GTT CAT TGT CGG TAC-3'

下游引物：5'-AAC GAA GCA TAA TGC CGC TA-3'

灵敏度与特异性

检测限（LOD）：≤5 copies/反应

特异性：

✔ 可检出所有已知S. mansoni亚型

✘ 不交叉反应：日本血吸虫（S. japonicum）、埃及血吸虫（S. haematobium）、肝片吸虫（Fasciola hepatica）

操作流程

样本前处理

粪便样本：采用QIAGEN Stool DNA Kit提取DNA

血清/钉螺组织：酚-氯仿法或商用DNA提取试剂盒

PCR扩增程序

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 采集模式 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | - |

| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 | SYBR |

| | 60℃ | 45 sec | | |

| 熔解曲线 | 65℃→95℃ | 0.5℃/sec | 1 | 连续采集 |

结果判读标准

| 结果类型 | Ct值范围 | 熔解曲线峰 |

| 阳性 | Ct ≤ 35.0 | 单一峰（Tm 82±0.5℃） |

| 可疑 | 35.0 < Ct < 38.0 | 需重复检测 |

| 阴性 | Ct ≥ 38.0 或未检出 | 无峰/杂峰 |

性能验证数据

重复性：批内/批间CV < 5%

符合率：

与镜检法相比：灵敏度98.2%（95% CI: 94.5-99.4%）

与巢式PCR相比：符合率99.1%

注意事项

实验分区操作（试剂准备区→样本处理区→扩增区）

熔解曲线出现双峰提示引物二聚体，应优化模板浓度

临床样本建议设置内参（如β-actin）监控抑制物

质量控制

每批试剂盒通过WHO参考品（NIBSC 19/204）验证

用户需每批次运行：

阳性对照（Ct值28±2）

阴性对照（Ct=40或Undetected）

NTC（无模板对照）

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