乙型肝炎病毒A型染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

预期用途

本试剂盒采用实时荧光定量PCR技术（染料法：SYBR Green I），结合特异性引物，用于定性及定量检测人血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒（HBV）DNA。适用于HBV感染的辅助诊断、治疗监测及疗效评估。本试剂盒可检测已知的HBV A-H基因型。

检测原理

核酸提取： 从血清或血浆样本中提取病毒DNA。

PCR扩增： 使用针对HBV基因组保守区域（如S区或C区）设计的高特异性引物进行扩增。

荧光检测： PCR反应体系中加入SYBR Green I荧光染料。该染料能特异性地嵌入双链DNA(dsDNA)小沟中，在激发光照射下发出荧光。随着PCR循环的进行，扩增产物量（dsDNA）不断增加，荧光信号强度也随之增强。

定量分析： 仪器实时监测每个反应管内的荧光信号变化。通过检测达到荧光阈值（Threshold）所需的循环数（Ct值），结合标准品绘制的标准曲线，即可计算出样本中HBV DNA的拷贝数或国际单位（IU/mL）。

主要组成成分

| 组分名称 | 规格 (48测试) | 规格 (96测试) | 主要成分及作用 |

| qPCR预混液 (2X) | 1.0 mL x 1管 | 1.0 mL x 2管 | 热启动Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、SYBR Green I荧光染料、稳定剂、优化缓冲液。 |

| HBV特异性引物混合液 (10X) | 120 μL x 1管 | 120 μL x 2管 | 针对HBV保守区域设计的特异性上游和下游引物。 |

| HBV DNA阳性定量标准品 | 5管 | 5管 | 含已知浓度（如 10^2, 10^3, 10^4, 10^5, 10^6 IU/mL 或 copies/mL）的HBV DNA片段。 |

| 阴性对照 (NTC) | 1管 (1 mL) | 1管 (1 mL) | 无核酸酶水或阴性血清基质。 |

| 无核酸酶水 | 1 mL x 1管 | 1 mL x 2管 | 用于稀释和复溶。 |

| (可选) 内标 (IC) 及引物 | - | - | 用于监控提取和扩增过程，防止假阴性（部分试剂盒包含）。 |

| (可选) UDG/dUTP 防污染系统 | - | - | 含dUTP和尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，防止扩增产物污染（部分试剂盒包含）。 |

储存条件及有效期：

-20℃ ± 5℃ 避光保存。避免反复冻融（建议分装）。

有效期：12个月（自生产日期起）。开封后根据组分不同，按说明书要求保存（通常预混液和引物短期可4℃保存，长期需-20℃；标准品和对照品建议-20℃保存）。

样本要求

样本类型： 人血清或乙二胺四乙酸（EDTA）、枸橼酸钠抗凝的血浆。避免使用肝素抗凝血浆（肝素抑制PCR反应）。

采集与处理： 无菌采集静脉血，按常规方法分离血清或血浆。避免溶血、脂血。

储存： 新鲜样本建议尽快检测。如不能立即检测，2-8℃可保存不超过72小时；长期保存需置于-20℃或-70℃，避免反复冻融。

运输： 冰袋或干冰运输。

检验方法

样本处理与核酸提取：

严格按照所选用病毒核酸提取试剂盒的操作说明书进行。使用100-200μL血清/血浆样本进行提取。

洗脱/溶解体积：根据提取试剂盒要求或后续PCR反应体系决定（常用30-60μL无核酸酶水或洗脱液）。

提取的DNA应立即进行PCR检测，或暂存于-20℃（短期）/ -70℃（长期）。

试剂准备（冰上操作）：

将所需组分（qPCR预混液 (2X)、HBV引物混合液 (10X)、阳性标准品、阴性对照、无核酸酶水）从冰箱取出，完全融化并混匀，短暂离心备用。

阳性标准品梯度稀释：按照说明书要求，用阴性对照或无核酸酶水对阳性定量标准品进行系列稀释（至少5个梯度），制备标准曲线。

PCR反应体系配制（以单反应20μL体系为例）：

| 组分 | 体积 (μL) |

| qPCR预混液 (2X) | 10.0 |

| HBV引物混合液 (10X) | 2.0 |

| 无核酸酶水 | 3.0 |

| 模板DNA | 5.0 |

| 总体积 | 20.0 |

轻柔混匀反应液，短暂离心。

每个样本/对照均需做双孔或三孔重复。

加样：

将配制好的反应液分装至PCR反应管/板孔中（每孔15μL不含模板的反应液）。

分别加入对应模板：

待测样本DNA：5μL

阴性对照 (NTC)：5μL

各浓度梯度阳性标准品：5μL

(如有) 内标对照：按说明加入

PCR扩增与检测：

盖好管盖/封板膜，将反应管/板置于荧光定量PCR仪中。

设置反应程序（示例，需根据具体试剂盒优化）：

预变性： 95℃, 3-5分钟 (激活热启动酶)

循环扩增 (40-45循环)：

变性: 95℃, 10-15秒

退火/延伸：60℃, 30-60秒 (在此阶段采集SYBR Green荧光信号)

(可选) 熔解曲线分析：

95℃, 15秒

60℃, 1分钟

缓慢升温至95℃ (如0.3-0.5℃/秒)，连续采集荧光信号。

结果判读：

有效性判定：

阴性对照 (NTC)： Ct值应为“Undetected”或大于设定的无效值（如40）。

阳性标准品： 各浓度梯度应能有效扩增，Ct值与浓度呈良好线性关系（R² > 0.98）。标准曲线斜率为-3.3左右。

(如有) 内标 (IC)： 所有样本（包括阳性和阴性）的内标通道均应扩增良好，表明提取和扩增过程有效。若样本HBV通道阴性但内标也阴性，则为无效，需重检。

样本结果判定：

阳性： 样本在HBV检测通道出现典型的S型扩增曲线，且Ct值小于设定的阳性判断值（例如 ≤ 38或40，具体值由试剂盒性能验证确定）。熔解曲线分析显示单特异的熔解峰Tm值（应与标准品主峰Tm值一致），用于排除非特异性扩增和引物二聚体。

阴性： 样本在HBV检测通道未出现扩增曲线或Ct值大于阳性判断值。熔解曲线无特异性峰或Tm值不符。

定量： 根据样本的Ct值，利用标准曲线（Log浓度 vs Ct值）计算出样本中HBV DNA的浓度（单位：IU/mL 或 copies/mL）。报告时应注明定量下限（LLOQ）和检测下限（LOD）。

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