乙型肝炎病毒E型染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

性能参数

检测方法：染料法荧光定量PCR技术

灵敏度：分析灵敏度可以达到100拷贝/反应

特异性：根据乙型肝炎病毒E型保守基因序列设计的引物，与其他亚型病毒及相关病毒无交叉反应

线性范围：用于定量检测时线性范围至少为5个数量级

重复性：板内、板间变异系数均小于15%

样本适用范围

可检测多种类型样本：

全血、血清、血浆

肝组织匀浆、细胞培养物上清

其他含乙型肝炎病毒E型的生物样本

实验操作流程

一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)

注意：由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。

标记6个离心管，分别为7,6,5,4,3,2。

用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液(最好用带芯枪头，下同)。

在7号管中加入5μL1×10E8拷贝/μL的阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。

换枪头，在6号管中加入5μL1×10E7拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。

换枪头，在5号管中加入5μL1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。

重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

如果有N个样品，必须设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4拷贝/μL，10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5拷贝/μL，10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品，则PC和NC的体积也必须是200μL。

用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的一管式病毒DNAout或其升级版柱式病毒DNAout。本试剂盒免费赠送15次一管式病毒DNAout。

三、设置qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

如果只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于PCR阳性对照。

在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分 样品管N+2个 PCR阴性对照管 PCR阳性对照管(2-7管)

2×qPCR MagicMix 10μL 10μL 各10μL

乙型肝炎病毒E型染料法qPCR引物混合液 2μL 2μL 各2μL

自备10×ROX(见注) 2μL 2μL 各2μL

N+2待测样品cDNA模板 6μL 不加 不加

第7步所得PCR阳性对照稀释液(2-7号) 不加 不加 各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)

注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器(如iCyclerIQ、MJOption、MJChromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene6000和LightCycler480)不需要使用ROX，则用水替代。

盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)：

过程 温度 时间

预变性 95℃ 5min

(35个循环) 95℃ 15sec

60℃ 1min(采集SYBR通道的荧光信号)

熔解曲线分析 按仪器预设程序进行 -

四、数据采集与处理

数据采集：具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时，最大吸收光谱在471nm，结合DNA时的最大吸收光谱在500nm，最大发射光谱在530nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。

数据处理：

如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。

如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于30。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

注意事项

样品采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下，严禁反复冻融。

不同批号的试剂盒组分不可交互使用。

操作严格按照说明书进行，试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心。

反应液应避光保存，反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧。

阳性对照浓度较高，稀释操作一定要在独立的区域进行，避免污染样品或本试剂盒的其他成分。

所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

自备试剂：DNA模板、10×ROX(根据机型决定，具体见使用方法)。

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