美洲四棱线虫染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

产品原理

本试剂盒采用荧光染料法（如SYBR Green I）进行实时荧光定量PCR检测。染料可特异性嵌入双链DNA小沟，在结合DNA后发射530 nm荧光信号，其强度与扩增产物量成正比。通过实时监测荧光信号变化，结合标准曲线或阈值循环数（Ct值），实现对美洲四棱线虫（Tetrameres americana）DNA的定性与定量分析。

组分与性能参数

主要组分：

预混qPCR Master Mix（含DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液及优化剂）

特异性引物对（针对美洲四棱线虫靶基因设计）

荧光染料（激发波长471 nm，发射波长530 nm）

阳性对照（含靶序列DNA）

阴性对照（无模板对照，NTC）

灵敏度：可检测低至10拷贝/μL的靶序列。

特异性：引物经生物信息学验证，避免与其他线虫物种交叉反应。

操作步骤

样本制备：提取待测样本DNA，建议浓度10-100 ng/μL。

反应体系配制（以20 μL为例）：

预混Master Mix：10 μL

引物混合液：2 μL

模板DNA：2 μL

无核酸酶水：补至20 μL

PCR程序设置：

预变性：95℃ 5 min（激活酶及模板变性）

循环阶段（40 cycles）：95℃ 15 sec → 60℃ 30 sec（信号采集）

熔解曲线分析（可选）：60℃至95℃，升温速率0.5℃/sec

数据分析

定量检测：

以阳性对照的log浓度为横轴、Ct值为纵轴绘制标准曲线。

通过待测样本Ct值计算初始模板浓度。

定性判定：

阴性对照Ct≥40，阳性对照Ct≤30且呈典型扩增曲线。

待测样本Ct≤35判为阳性；Ct≥40判为阴性；35<Ct<40需复测确认。

注意事项

避免反复冻融试剂，配制反应体系时需在冰上操作。

熔解曲线分析可验证扩增特异性，单一峰表明无引物二聚体或非特异产物。

若扩增效率异常（标准曲线斜率偏离-3.3±0.1），建议优化模板浓度或重新设计引物。

常见问题解决

无扩增信号：检查模板完整性或抑制剂存在。

高背景噪声：确保避光操作，避免染料降解。

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