鸟类髓细胞瘤病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品用途

科研实验，用于鸟类髓细胞瘤病毒RNA的荧光定量RT-PCR检测。

试剂盒组成

RT-PCR预混液：包含逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液及荧光染料（如SYBR Green）。

阳性对照：梯度稀释的AMV RNA标准品（10^7~10^2拷贝/μL），用于标准曲线绘制。

阴性对照：无RNA酶水，用于排除污染。

引物探针混合液：特异性靶向AMV基因的引物及探针（染料法无需探针）。

实验步骤

1. 样本准备

待测样本需提取总RNA，纯度要求A260/A280比值1.8~2.0。

阳性对照稀释：按10倍梯度稀释（10^6~10^1拷贝/μL），每管取5 μL转移至下一梯度，震荡混匀。

2. PCR反应体系（20 μL）

| 组分 | 体积（μL） |

| RT-PCR预混液 | 10 |

| 引物混合液 | 2 |

| 模板RNA（或对照） | 5 |

| 无RNA酶水 | 补至20 |

注意：

需设置3次重复，阴性对照（NC）不加模板。

部分仪器（如ABI7500/7700/7900）需添加ROX校正染料，其他机型（iCycler IQ、LightCycler480等）无需添加。

3. 反应程序

| 步骤 | 温度/时间 | 循环数 |

| 逆转录 | 50℃ 30 min | 1 |

| 预变性 | 95℃ 5 min | 1 |

| 变性 | 95℃ 15 sec | 40 |

| 退火/延伸 | 60℃ 1 min | |

4. 数据分析

仪器自动生成Ct值，以阳性对照Ct值为纵轴、拷贝数对数为横轴绘制标准曲线。

通过标准曲线计算待测样本的病毒载量。

注意事项

避免反复冻融试剂，分装后使用。

操作需在无RNA酶环境下进行，防止降解。

若出现非特异性扩增，建议优化退火温度或重新设计引物。

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