产气荚膜梭状芽孢杆菌A型染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

产气荚膜梭状芽孢杆菌A型染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

检测原理

本试剂盒采用 SYBR Green I 荧光染料法，靶向产气荚膜梭菌A型特异性基因 α-毒素基因（cpa），通过qPCR扩增曲线与熔解曲线分析，实现对样本中产气荚膜梭菌A型DNA的定性与定量检测。

适用样本类型

食品（肉类、乳制品、饲料）

环境拭子

粪便/肠道内容物

临床标本（需经核酸提取）

试剂盒组分（48测试示例）

| 组分 | 体积/数量 |

| 2× qPCR Master Mix (SYBR) | 1.25 mL × 1管 |

| cpa 引物混合液（10μM） | 100 μL × 1管 |

| 阳性对照（C. perfringens Type A DNA） | 50 μL × 1管 |

| 阴性对照（无菌水） | 1 mL × 1管 |

| RNase-Free Water | 1 mL × 1管 |

检测灵敏度与特异性

灵敏度：≤ 10 拷贝/反应

特异性：

可特异性检出产气荚膜梭菌A型（含cpa基因菌株）

不与其他梭菌（如艰难梭菌、败毒梭菌）或常见肠道菌（大肠杆菌、沙门氏菌）交叉反应

实验步骤

1. 样本DNA提取

使用商业核酸提取试剂盒（如QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit）处理样本，建议DNA终浓度≥10 ng/μL。

2. qPCR反应体系配制（20μL体系）

| 组分 | 体积 |

| 2× SYBR Master Mix | 10 μL |

| 引物混合液 | 0.8 μL |

| 模板DNA | 2 μL |

| RNase-Free Water | 7.2 μL |

3. qPCR反应程序

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |

| 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 |

| 变性 | 95℃ | 15 sec | |

| 退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | 40 |

| 熔解曲线 | 60℃→95℃ | 0.5℃/sec | 1 |

仪器推荐：ABI 7500, Bio-Rad CFX96, Roche LightCycler 480

结果判读

阳性：

Ct值 ≤ 35，且熔解曲线峰值Tm = 86±1℃（需与阳性对照一致）

可疑：

Ct值 35~38，建议重复检测

阴性：

无扩增曲线或Ct值＞38，熔解曲线无目标峰

质量控制

阴性对照：Ct值=Undet，熔解曲线无杂峰

阳性对照：Ct值≤30，Tm值符合预期

内参基因（可选）：可添加管家基因（如16S rRNA）排除抑制剂干扰

注意事项

生物安全：操作中穿戴防护装备，废弃样本按生物危险品处理！

防污染：试剂配制区与样本处理区分区操作，使用带滤芯枪头。

熔解曲线必做：验证扩增特异性，避免假阳性。

避免反复冻融：分装保存引物与对照品。

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