中华绒螯蟹呼肠孤病毒RNA核酸检测试剂盒（恒温荧光法） 新品

 产品介绍：

该试剂盒主要用于水产养殖领域，针对中华绒螯蟹（俗称大闸蟹）的呼肠孤病毒（Reovirus）进行快速检测，帮助养殖户和检测机构预警“水瘪子”等由病毒引起的疾病。

该技术基于恒温荧光法（通常为RT-LAMP或RAA技术），具有操作简便、速度快（通常45分钟内出结果）、无需复杂PCR仪器等优点。

 �� 产品核心信息

检测对象：中华绒螯蟹呼肠孤病毒（Eriocheir sinensis reovirus）。

检测原理：反转录-恒温荧光扩增法（RT-Isothermal Amplification）。针对病毒RNA的保守基因序列（如S14或M9片段）设计特异性引物和探针，在恒温（通常为63℃或37℃，视具体技术而定）条件下进行扩增。

适用仪器：

恒温荧光检测仪（如 Genie II, DHelix-C, ESE Tube Scanner）。

荧光定量PCR仪（如 ABI 7500，需设置FAM通道）。

恒温水浴锅或金属浴（仅用于肉眼观察颜色变化）。

检测样本：蟹的肝胰腺、鳃、肌肉组织匀浆液，或养殖水体富集样本。

�� 试剂盒组成（以48T为例）

组分名称  规格  作用说明

病毒RNA提取液  500 μL x 2管  用于裂解样本，释放病毒RNA（含裂解酶和缓冲液）

RT-RAA/RT-LAMP反应液  22 μL x 48管  预混液，含引物、dNTPs、逆转录酶、Bst酶等

酶混合液 (Enzyme Mix)  50 μL x 1管  含逆转录酶和扩增酶（需-20℃保存，避免反复冻融）

阴性对照 (NC)  50 μL x 1管  不含病毒核酸，用于监控环境或试剂污染

阳性对照 (PC)  50 μL x 1管  含目标病毒RNA片段，用于验证试剂有效性

�� 操作流程详解

1. 样本处理与RNA提取

组织样本：取蟹的肝胰腺或鳃组织约20-50 mg，加入300-500 μL 生理盐水，使用组织研磨器制备匀浆。

提取RNA：

取200 μL 匀浆液加入离心管中。

加入等体积（200 μL）的病毒RNA提取液，震荡混匀。

56℃水浴 15-30分钟（裂解病毒释放RNA）。

10000 rpm离心2分钟，取上清液（即粗提RNA）作为模板备用。

注：部分一步法试剂盒可直接使用少量裂解液作为模板，无需纯化。

2. 反应体系配制

计算用量：根据待测样本数量（N），计算所需反应液总量（N+2）x 单管用量。

配制步骤：

在冰上解冻RT-RAA/RT-LAMP反应液和酶混合液。

将反应液与酶混合液按说明书比例混合（通常为19:1或20:1）。

每管分装20-25 μL混合液。

3. 加样与扩增

加样：向每管反应液中加入 2-5 μL 模板RNA（阴性对照加阴性对照品，阳性对照加阳性对照品）。

上机：

荧光检测模式：放入恒温荧光仪，设置检测通道为FAM，反应温度设定为63℃（或37℃，视具体技术而定），反应时间40-60分钟。

肉眼观察模式：若试剂盒含SYBR Green I等染料，反应结束后在365nm紫外灯下观察，绿色为阳性，橙色/红色为阴性。

⚠️ 注意事项

防污染：RNA酶（RNase）无处不在，极易降解RNA导致假阴性。操作时务必佩戴口罩、手套，使用无RNA酶的枪头和离心管。

酶活性：酶混合液对温度敏感，解冻后应置于冰上，避免长时间暴露在室温下。

假阳性风险：恒温扩增效率极高，产物气溶胶极易造成污染。严禁在加样区打开扩增后的管盖，废弃物应密封处理。

临床意义：本试剂盒仅用于科研或疫病筛查，检测结果仅供参考，不能作为临床诊断的唯一依据，需结合蟹的临床症状（如厌食、空肠、肝脏萎缩等）综合判断。

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注意事项

防污染操作

需在试剂准备区、样本处理区、扩增区独立操作，使用带滤芯吸头及专用实验服。

阳性对照管理

浓度高达1×10⁸拷贝/μL，需单独存放并避免污染其他试剂。

局限性

仅限科研使用，不可用于临床诊断；

环境样本中可能存在PCR抑制剂，需设置内参对照。