丙型肝炎病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 新品

检测原理

本试剂盒采用实时荧光定量RT-PCR技术，结合特异性引物探针与荧光染料（如SYBR Green I），实现对HCV RNA的定量检测：

RNA提取：样本中HCV RNA经纯化后作为模板。

逆转录：在逆转录酶作用下合成cDNA。

荧光定量PCR：

引物靶向HCV基因组保守区（如5'UTR区）

DNA聚合酶扩增目标片段，SYBR Green染料嵌入双链DNA发出荧光

荧光信号强度与产物量成正比，通过标准曲线计算病毒载量（IU/mL）

试剂盒组分

| 组分名称 | 48测试用量 | 主要成分 |

| HCV RT-PCR反应液 | 1.2 mL | 引物、dNTPs、SYBR Green I |

| 酶混合液 | 100 μL | 逆转录酶、Taq DNA聚合酶 |

| HCV阳性定量标准品(5×10⁵ IU/mL) | 4管 | 梯度稀释用标准品 |

| 阴性对照 | 1 mL | RNase-free水 |

| RNase-free纯水 | 1 mL | —— |

| 注：需自备RNA提取试剂盒 | | |

性能参数

检测限：15 IU/mL（95%概率检出）

线性范围：10² ~ 10⁸ IU/mL（R² ≥ 0.99）

特异性：

不与其他肝炎病毒（HBV、HAV等）或人源核酸交叉反应

可检测HCV 1-6基因型

精密度：

批内/批间CV ≤ 5%（高浓度样本）

批间CV ≤ 10%（临界值附近样本）

操作流程

1. 样本准备

适用样本：血清/血浆（EDTA或枸橼酸钠抗凝）

RNA提取：使用配套RNA提取试剂盒，洗脱体积≤50 μL

2. 反应体系配制

| 组分 | 单反应体积 |

| RT-PCR反应液 | 15 μL |

| 酶混合液 | 1 μL |

| RNA模板 | 5 μL |

| 总体积 | 21 μL |

3. PCR程序设置

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 逆转录 | 50℃ | 15 min | 1 | 关闭 |

| 预变性 | 95℃ | 2 min | 1 | 关闭 |

| 扩增 | 95℃ | 10 sec | 40 | 开启 |

| | 60℃ | 30 sec | | |

结果判读

阈值设定：取指数扩增期荧光信号阈值（建议基线3-15循环）

定量分析：

以标准品（10⁸~10² IU/mL）建立标准曲线

根据Ct值自动计算样本HCV RNA浓度

有效性判定：

阳性对照：Ct ≤ 35

阴性对照：无扩增曲线

内参基因（若含）：需正常扩增

注意事项

生物安全

实验分区操作（试剂准备区/样本处理区/PCR区）

穿防护服并定期更换手套

质量控制

每批次实验必须包含阴性/阳性对照

避免试剂反复冻融（建议分装保存）

临床意义

病毒载量＞10⁵ IU/mL提示高复制活性

治疗中下降≥2 log₁₀视为有效应答

局限性

不适用于：

肝组织或粪便样本（需验证）

病毒载量＜10² IU/mL的样本

干扰物质：

血红蛋白＞2 mg/mL

胆红素＞0.5 mg/mL

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