大鼠白血病病毒染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 新品

预期用途

本试剂盒基于SYBR Green I 荧光染料法，用于定性或定量检测大鼠样本（血液、组织、细胞培养物）中的大鼠白血病病毒（RLV）RNA。适用于：

实验大鼠RLV感染的早期诊断与监测

大鼠生物制品（如血清、细胞系）的RLV污染筛查

抗病毒药物或疫苗研究中的病毒载量评估

检测原理

RNA提取：从样本中纯化总RNA。

逆转录 (RT)：以RNA为模板，利用逆转录酶合成cDNA。

荧光定量PCR (qPCR)：

使用特异性引物扩增RLV目标基因（如pol、gag 或 env 基因保守区）。

SYBR Green I染料嵌入双链DNA产物中，释放荧光信号。

实时监测荧光强度，通过扩增曲线（Ct值）判定病毒RNA含量。

试剂盒组成

| 组分名称 | 体积/数量 | 保存条件 |

| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 1 mL / 瓶 | -20℃ |

| RT Enzyme Mix | 50 μL / 管 | -20℃ |

| RNase-Free Water | 1 mL / 瓶 | 室温 |

| RLV特异性引物混合液 (Primer Mix) | 100 μL / 管 | -20℃ |

| 阳性对照 (RLV RNA) | 50 μL / 管 | -80℃ |

| 阴性对照 (无核酸水) | 1 mL / 瓶 | 室温 |

实验需自备材料

RNA提取试剂盒（如TRIzol®）

实时荧光定量PCR仪

无RNase的PCR管、吸头、离心管

离心机、涡旋混合器

冰盒、移液器

操作流程

1. 样本RNA提取

按RNA提取试剂盒说明书操作，用80 μL无RNase水溶解RNA沉淀。

测定RNA浓度（OD260/280 ≈ 1.8~2.0），置于冰上备用。

2. 逆转录反应 (RT)

| 组分 | 体积 |

| 总RNA | ≤ 500 ng |

| 引物混合液 (Primer Mix) | 2 μL |

| RT Enzyme Mix | 1 μL |

| RNase-Free Water | 补至10 μL |

程序：37℃ 15 min → 85℃ 5 sec → 4℃保存。

3. 荧光定量PCR (qPCR)

| 组分 | 体积 |

| 2× SYBR Green Master Mix | 10 μL |

| cDNA产物 | 2 μL |

| RNase-Free Water | 7 μL |

| 总体积 | 20 μL |

扩增程序（以Bio-Rad CFX为例）：

95℃   3 min  (预变性)  

循环40次：  

   95℃   10 sec  

   60℃   30 sec  （荧光采集）  

熔解曲线：65℃ → 95℃，每0.5℃采集荧光  

结果判读

有效性判定：

阴性对照：无扩增曲线（Ct值=Undet）

阳性对照：Ct值 ≤ 35，且熔解曲线为单峰

样本判定：

阳性：Ct值 ≤ 38，熔解曲线峰与阳性对照一致

阴性：Ct值=Undet 或 Ct值>38

可疑：熔解曲线异常 → 建议重复检测

注意事项

严格分区操作：RNA提取、RT反应、qPCR反应需在不同超净台/房间进行，避免污染。

试剂保存：Master Mix、引物避光保存，反复冻融≤3次。

模板质量：降解RNA可导致假阴性；建议同时扩增大鼠内参基因（如β-actin）验证RNA完整性。

熔解曲线分析：是区分特异性产物与非特异性扩增的关键步骤。

性能参数

灵敏度：可检测≥10 copies/μL的病毒RNA

特异性：不与大鼠其他常见病毒（如RPV、H-1）交叉反应

重复性：批内/批间Ct值变异系数（CV）< 2%

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