超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

产品概述

本试剂盒采用染料法荧光定量PCR技术，专用于检测超广谱β-内酰胺酶（ESBL）大肠埃希菌的DNA，适用于科研实验。试剂盒包含预混优化的引物、反应缓冲液、酶及阳性对照，具有高灵敏度和特异性，可定性或定量分析目标基因，线性范围覆盖5个数量级。

性能参数

灵敏度：100拷贝/反应（线性范围10¹–10⁸拷贝/μL，参考临床样本检测数据）

特异性：与非ESBL大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等无交叉反应（通过溶解曲线Tm值差异验证，目标Tm=83±1℃）

重复性：批内CV<3%，批间CV<5%（n=8次重复实验，针对阳性对照梯度稀释样本）

反应时间：全程约2小时（含样本前处理30分钟+PCR扩增1.5小时）

试剂盒组成

（50次/盒）

2×qPCR Magic Mix 500μL（棕色管） 含热启动DNA聚合酶、dNTP、SYBR Green I染料

ESBL引物混合液 100μL (10μM) 扩增ESBL编码基因保守区（覆盖CTX-M/TEM/SHV型）

阳性对照（质粒DNA） 50μL (1×10⁸ copies/μL) 含blaCTX-M基因片段，用于验证扩增有效性

DNA抽提液（试用装） 9mL 快速裂解细菌释放DNA（含溶菌酶和去污剂）

荧光PCR专用模板稀释液 1mL（黄盖） 阳性对照梯度稀释

操作步骤

试剂准备

解冻与离心：将试剂盒组分（MasterMix、引物、阳性对照等）置于冰上解冻，短暂离心混匀。

标准品稀释（定量检测需制备标准曲线）：

使用专用稀释液将阳性对照（1×10^8拷贝/μL）按10倍梯度稀释至10^2–10^7拷贝/μL，每个梯度需更换枪头避免交叉污染。

反应体系构建

每20μL反应体系建议配比：

MasterMix（含染料、dNTPs、酶）：10μL

引物混合液：2μL

DNA模板：2μL（50ng–1μg）

ddH2O：补足至20μL

PCR程序设置

扩增参数（以常规仪器为例）：

预变性：95℃ 3分钟

循环阶段（35次）：95℃ 30秒 → 58℃ 30秒 → 72℃ 45秒

终延伸：72℃ 5分钟

数据分析

使用荧光定量PCR仪采集Ct值，通过标准曲线计算样本中目标基因的拷贝数。

注意事项

防污染措施：操作分区进行（试剂准备、样本处理、扩增区），使用带滤芯枪头。

质量控制：每批次实验需包含阴性对照（无模板对照）和阳性对照。

样本要求：DNA模板需纯化，避免抑制剂干扰。

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