牛分枝杆菌卡介苗染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

性能参数

灵敏度：50拷贝/反应（线性范围10¹–10⁶拷贝/μL，优于普通牛分枝杆菌试剂盒）

特异性：与牛分枝杆菌野毒株（M. bovis）、结核分枝杆菌（M. tuberculosis）无交叉反应（通过Tm值差异验证：BCG Tm=82±1℃，野毒株Tm=86±1℃）

重复性：批内CV<2.5%，批间CV<4%（n=8次重复实验，针对疫苗原液样本）

反应时间：全程约3小时（含样本前处理1.5小时+PCR扩增1.5小时）

试剂盒组成

（50次/盒）

2×BCG qPCR Mix 500μL（棕色管） 含热启动酶、dNTP、SYBR Green I（优化抗抑制剂配方）

BCG特异性引物混合液 100μL (10μM) 扩增RD1区缺失旁侧序列（正向：5'-GCTGCGATCGCTGACGTT-3'，反向：5'-CGTCGTCGACGGTGACGTA-3'）

BCG阳性对照（质粒DNA） 50μL (1×10⁸ copies/μL) 含RD1区缺失片段的重组质粒（区分野毒株的关键对照）

疫苗株/野毒株鉴别对照 各20μL 用于溶解曲线Tm值验证（BCG Tm=82℃，野毒株Tm=86℃）

产品特点

即开即用：用户仅需提供待测DNA模板，操作简便。

高灵敏度与特异性：引物针对牛分枝杆菌卡介苗高度保守区设计，避免与其他微生物DNA/RNA交叉反应。

质量控制：提供阳性对照（1×10^8拷贝/μL），有效区分假阴性结果。

兼容性：含上样染料，PCR产物可直接电泳分析。

应用范围：支持定性与定量检测，定量线性范围达5个数量级。

关键操作要点

样本采集与保存：

疫苗样本需2–8℃避光保存，复溶后2小时内完成检测；

免疫动物组织需4%多聚甲醛固定或液氮速冻，避免BCG在样本中过度繁殖影响定量准确性。

反应体系与程序（20μL体系）：

① 试剂混合（冰上操作）：

  2×BCG qPCR Mix 10μL + 引物混合液 2μL + 模板DNA 5μL + 无酶水 3μL  

② 扩增程序：

  95℃预变性 10分钟 → 45循环（95℃ 15秒 → 62℃ 1分钟，采集荧光）→ 溶解曲线分析（65℃→95℃，每0.5℃停留5秒）

结果判读标准：

BCG阳性：Ct≤35且溶解曲线单一峰值（Tm=82±1℃）；

野毒株阳性：Ct≤35且Tm=86±1℃（需用特异性探针法进一步验证）；

阴性：Ct≥38或无扩增（需同时满足阴性对照无Ct值）。

特异性保障措施

引物设计策略：针对BCGRD1区缺失片段两侧保守序列设计引物，野毒株因存在完整RD1区导致扩增片段长度增加（BCG产物180bp vs 野毒株320bp），溶解曲线Tm值差异≥4℃；

抑制物处理：疫苗佐剂（如铝盐）样本需添加0.5% Tween-20和1% BSA消除PCR抑制，组织样本建议用磁珠法+DNA纯化柱联合提取；

对照体系设置：每批次实验需同时设置BCG阳性对照（验证扩增效率）、野毒株对照（验证特异性）和无模板对照（监控污染）。

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