铅黄肠球菌染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

铅黄肠球菌染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

检测原理

基于SYBR Green I荧光染料法，通过特异性引物扩增铅黄肠球菌EF0686基因保守区域（长度：152bp），实时监测荧光信号强度，实现对靶标DNA的定量检测。

应用范围

临床标本（血液、尿液、组织）中铅黄肠球菌的快速筛查

食品/环境样品微生物污染监测

耐药菌株（如万古霉素耐药表型）的辅助鉴定

组分清单（50T）

| 组分 | 体积/数量 | 保存条件 |

| qPCR Master Mix (2×) | 1.25 mL | -20℃避光 |

| E. casseliflavus 特异性引物混合液 | 100 μL | -20℃ |

| DNA提取试剂（裂解液+蛋白酶K） | 各1支 | 室温/-20℃ |

| 阳性对照（重组质粒，10⁴ copies/μL） | 50 μL | -20℃ |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | 室温 |

| RNase-Free Water | 1 mL | 室温 |

技术要求

| 参数 | 性能指标 |

| 灵敏度 | ≤ 10 copies/反应 |

| 线性范围 | 10¹~10⁷ copies/μL（R²≥0.99） |

| 特异性 | 不检出：粪肠球菌(E. faecalis)、屎肠球菌(E. faecium)、金黄色葡萄球菌等20种常见病原体 |

| 扩增效率 | 90%~110% |

| 批内精密度 | CV≤5% |

| 批间精密度 | CV≤8% |

操作流程

1. DNA提取（以血液样本为例）

① 取200 μL样本 + 20 μL蛋白酶K + 200 μL裂解液 → 56℃ 30 min

② 95℃ 10 min灭活 → 12,000 rpm离心5 min → 取上清作为模板

2. qPCR反应体系配制（20 μL体系）

| 组分 | 用量 |

| 2× Master Mix | 10 μL |

| 引物混合液 | 0.8 μL |

| DNA模板 | 2 μL |

| RNase-Free Water | 补至20 μL |

3. 扩增程序（ABI 7500仪器）

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 无 |

| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 | 每轮结束 |

| | 60℃ | 45 sec | | |

| 熔解曲线 | 60℃→95℃ | 每0.3℃升温 | 1 | 连续采集 |

结果判读标准

阳性：Ct值≤35，且熔解曲线为单峰（Tm=83.5±0.5℃）

可疑：Ct值35-38 → 建议重复检测

阴性：无Ct值或Ct≥38

注意事项

⚠️ 操作全程需在PCR洁净台中进行，穿戴无菌手套

⚠️ 熔解曲线出现多峰提示非特异性扩增 → 需优化模板浓度

⚠️ 试剂反复冻融≤3次，避免荧光信号衰减

⚠️ 阳性对照Ct值应在28±2范围内

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