曼氏杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒染料法荧光定量PCR试剂盒

曼氏杆菌通用染料法荧光定量PCR试剂盒

商品属性

检测原理

采用SYBR Green染料法实时荧光定量PCR技术，针对病原体保守基因区域设计特异性引物，通过监测扩增过程中的荧光信号实现定性/定量分析。

适用样本类型及前处理要点

样本类别 具体样本示例 前处理关键步骤

临床样本 牛鼻腔拭子、支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆 ① 拭子用2mL生理盐水洗脱 → 8000rpm离心3min取沉淀

② 加入DNA抽提液（含溶菌酶）100℃加热10min裂解

动物源性样本 羊扁桃体、淋巴结组织、生鲜肉表面擦拭物 ① 组织块（50mg）研磨后加蛋白酶K裂解液（56℃消化30分钟）

② 13000rpm离心5min取上清，磁珠法纯化DNA

环境与饲料样本 养殖场空气滤膜、青贮饲料、饮用水 ① 滤膜剪碎后加CTAB裂解液（65℃孵育20分钟）

② 饲料样本需37℃增菌培养18小时后再提取DNA

性能参数

灵敏度：100拷贝/反应（线性范围10¹–10⁸拷贝/μL，参考葡萄糖苷曼氏杆菌试剂盒数据）

特异性：与巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌等近缘菌无交叉反应（通过溶解曲线Tm值差异验证，目标Tm=85±1℃）

重复性：批内CV<3%，批间CV<5%（n=8次重复实验，针对阳性对照梯度稀释样本）

反应时间：全程约2小时（含样本前处理30分钟+PCR扩增1.5小时）

试剂盒组成（50次/盒）

组分 规格 用途

2×qPCR Magic Mix 500μL（棕色管） 含热启动DNA聚合酶、dNTP、SYBR Green I染料

曼氏杆菌通用引物混合液 100μL (10μM) 扩增属特异性保守区（覆盖溶血性曼氏杆菌、葡萄糖苷曼氏杆菌等）

阳性对照（质粒DNA） 50μL (1×10⁸ copies/μL) 验证扩增有效性（含16S rRNA基因片段）

DNA抽提液（试用装） 9mL 快速裂解细菌释放DNA（含去污剂和蛋白酶K）

荧光PCR专用模板稀释液 1mL（黄盖） 阳性对照梯度稀释

关键操作要点

样本采集与保存：

拭子样本需立即放入含抗生素的保存液（如青霉素+链霉素），4℃运输不超过24小时；

组织样本建议液氮速冻后-80℃保存，避免反复冻融导致DNA降解。

反应体系与程序（20μL体系）：

① 试剂混合（冰上操作）：

  2×qPCR Magic Mix 10μL + 引物混合液 2μL + 模板DNA 5μL + 无酶水 3μL  

② 扩增程序：

  95℃预变性 10分钟 → 40循环（95℃ 15秒 → 60℃ 1分钟，采集荧光）→ 溶解曲线分析（65℃→95℃，每0.5℃停留5秒）

结果判读标准：

阳性：Ct≤35且溶解曲线单一峰值（Tm=85±1℃）；

可疑：35<Ct<38，需用柱提法重新提取DNA验证；

阴性：Ct≥38或无扩增（需同时满足阴性对照Ct≥40）

防污染与质量控制措施

分区操作：样本处理、试剂配制、PCR扩增需在独立区域进行，使用带滤芯吸头和专用移液器；

阳性对照稀释：需在生物安全柜内操作，梯度稀释时每步更换枪头，避免气溶胶污染；

抑制物处理：饲料、粪便等复杂样本需添加1% BSA或5% DMSO消除PCR抑制物，必要时用磁珠法纯化DNA。

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