产品概述
本试剂盒采用SYBR Green I染料法荧光定量PCR (qPCR) 技术，用于特异性、高灵敏度地检测绵羊样本（如眼拭子、鼻拭子、结膜刮取物、病变组织等）中的莫拉克斯菌 (Moraxella ovis) 核酸。莫拉克斯菌是引起绵羊传染性角膜结膜炎（Infectious Keratoconjunctivitis, IKC）或“红眼病”的主要病原体之一。本试剂盒适用于临床诊断、流行病学调查、病原监测及科研等领域。
产品名称 | 绵羊莫拉菌染料法荧光定量PCR试剂盒 | 英文名称 | Moraxella ovis Dye-based qPCR Kit |
产品规格 | 50T | 产品分类 | 荧光定量PCR |
检测类型 | PCR检测 | 产品货号 | PR3372 |
检测原理
核酸提取： 从样本中提取总DNA（包含目标病原体DNA）。
PCR扩增： 利用特异性引物扩增绵羊莫拉菌靶基因（如16S rRNA基因、特定毒力因子基因或其他保守区域的特异性片段）。
荧光检测 (SYBR Green I)： SYBR Green I染料能特异性地嵌入双链DNA (dsDNA) 小沟中。在PCR扩增过程中，随着目标DNA产物的指数级增长，嵌入的染料量也相应增加。在特定波长（通常激发光~480nm，发射光~520nm）下检测到的荧光信号强度与PCR体系中dsDNA产物的量成正比。
定量/定性分析： 通过实时监测每个PCR循环结束时的荧光信号，仪器软件绘制扩增曲线。通过设定阈值线 (Threshold) 和计算循环阈值 (Ct值)，可以：
定性： 判断样本中是否存在莫拉菌DNA（Ct值 ≤ 设定的阳性判读值）。
相对定量： 比较不同样本中目标核酸的相对含量（通过Ct值差异）。
试剂盒组分
| 组分名称 | 规格 | 数量 | 储存条件 | 备注 |
| qPCR Master Mix (2X) | 1.25 mL | 1管 | -20℃避光 | 含DNA聚合酶、dNTPs、Mg²⁺、SYBR Green I染料、稳定剂等 |
| 绵羊莫拉菌引物混合物 (10X) | 200 µL | 1管 | -20℃避光 | 含特异性正向和反向引物 |
| 阳性对照 (Positive Control) | 200 µL | 1管 | -20℃避光 | 含已知浓度的绵羊莫拉菌DNA片段 |
| 阴性对照 (Negative Control) | 200 µL | 1管 | -20℃避光 | 无核酸水（Nuclease-Free Water） |
| 内标引物混合物 (可选, 10X) | 200 µL | 1管 | -20℃避光 | 用于检测内源性参照基因（如β-actin, GAPDH等），监控提取和扩增效率 |
| 无核酸水 (Nuclease-Free Water) | 1 mL | 1管 | 室温或4℃ | 用于稀释或溶解 |
| 说明书 | 1份 | | 室温 | |
操作步骤
(一) 样本核酸提取
按照自备的核酸提取试剂盒说明书，从待测绵羊样本中提取总DNA。确保操作过程避免交叉污染。
提取的DNA可立即用于qPCR检测，或**-20℃/-80℃保存**备用。
(二) 反应体系配制 (以20 µL体系为例，在冰上操作)
| 组分 | 体积 (µL) | 终浓度 |
| qPCR Master Mix (2X) | 10 | 1X |
| 绵羊莫拉菌引物混合物 (10X) | 2 | 1X |
| 内标引物混合物 (10X, 可选) | 2 | 1X (可选) |
| 模板DNA | 2-5 | - |
| 无核酸水 (Nuclease-Free Water) | 补足至 20 | - |
模板DNA体积： 根据预实验或经验确定最佳加入量（通常2-5 µL）。阴性对照和阳性对照使用相同体积。
内标： 如果使用内标，需在所有样本孔（包括对照） 中加入内标引物混合物和相应的内标模板（通常内标模板已整合在Master Mix或单独加入）。
混匀： 轻轻涡旋混匀反应液，短暂离心收集管壁液滴。避免产生气泡。
分装： 将配制好的反应液分装至PCR反应管/板的各孔中。
(三) 加样
在标记好的反应孔中依次加入：
阴性对照孔 (NTC)： 反应液 + 阴性对照 (无核酸水) 作为模板。
阳性对照孔 (PTC)： 反应液 + 阳性对照 (莫拉菌DNA) 作为模板。
待测样本孔： 反应液 + 待测样本DNA作为模板。
内标对照孔 (如适用)： 单独设置仅含内标模板的孔（可选）。
盖紧管盖/封板膜。
(四) 荧光定量PCR程序设置 (示例程序，需根据引物Tm值、仪器型号优化)
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 采集荧光信号 |
| 1. 预变性 | 95℃ | 3-5 min | 1 | 否 |
| 2. 循环扩增 | 95℃ | 10-15 sec | 40-45 | 否 |
| | [退火温度]* | 30-60 sec | | 是 |
| 3. 熔解曲线分析 | 95℃ | 15 sec | 1 | 否 |
| | 65℃ | 15 sec | | 否 |
| | 95℃ | - | | 连续采集 |
| | (或仪器默认熔解曲线程序) | | | |
退火温度 (Ta)： 这是最关键的参数。必须根据您使用的引物混合物的实际Tm值进行优化。通常在引物Tm值减3-5℃开始测试，通过实验确定最佳退火温度。常见范围可能在55-60℃之间，但务必以引物或试剂盒说明推荐为准。
熔解曲线： 程序结束后必须进行熔解曲线分析，以确认扩增产物的特异性和单一性（单一主峰）。
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