肠道病毒72型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒 新品

肠道病毒72型染料法荧光定量RT-PCR试剂盒

商品属性

预期用途

本试剂盒基于SYBR Green I 荧光染料法，用于定性检测临床样本（粪便、咽拭子、疱疹液等）中的肠道病毒71型（EV71）RNA，适用于手足口病病原体筛查、流行病学监测及实验室研究。

检测原理

RNA提取：样本中病毒RNA经纯化富集

逆转录（RT）：RNA逆转录为cDNA

荧光定量PCR：

使用EV71特异性引物扩增靶基因（通常为VP1或5'UTR保守区）

SYBR Green I染料嵌入双链DNA，释放荧光信号

实时监测扩增曲线，通过Ct值判定病毒载量

试剂盒组分

| 组分名称 | 规格 | 储存条件 |

| RT-PCR反应液 | 1.2 mL | -20℃避光 |

| EV71特异性引物干粉 | 2管 | -20℃ |

| RT酶混合液 | 100 μL | -20℃ |

| RNase-Free水 | 1 mL | 室温 |

| 阳性对照（EV71 RNA） | 50 μL | -80℃ |

| 阴性对照（DEPC水） | 1 mL | -20℃ |

注：不同批号组分不可混用，避免反复冻融。

适用仪器

主流荧光定量PCR仪：

Bio-Rad CFX96, ABI 7500, Roche LightCycler 480, QuantStudio 系列等

样本要求

| 样本类型 | 采集处理 | 保存条件 |

| 粪便 | 取1 g悬浮于PBS，离心取上清 | ≤24h（4℃）或-80℃冻存 |

| 咽拭子 | 置于病毒保存液，震荡洗脱 | ≤72h（4℃）或-80℃冻存 |

| 疱疹液 | 直接吸取或PBS稀释 | 立即检测或-80℃冻存 |

警告：样本需符合生物安全二级（BSL-2）操作规范。

检测流程

1. RNA提取

推荐使用配套核酸提取试剂盒（如柱提法/磁珠法），提取RNA溶于20-50 μL RNase-Free水。

2. 反应体系配制（20 μL/反应）

| 组分 | 体积 |

| RT-PCR反应液 | 10 μL |

| EV71引物混合物 | 2 μL |

| RT酶混合液 | 1 μL |

| RNA模板 | 5 μL |

| RNase-Free水 | 补至20 μL |

3. PCR程序设置

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 逆转录 | 50℃ | 15 min | 1 | 关 |

| 预变性 | 95℃ | 3 min | 1 | 关 |

| 扩增 | 95℃ | 10 sec | 40 | 每循环结束采集 |

| | 60℃ | 30 sec | | |

结果判读

有效性判定：

阳性对照：Ct ≤ 32，扩增曲线呈S型

阴性对照：Ct = 40或无扩增曲线

NTC（无模板对照）：无扩增

样本判定：

阳性：Ct ≤ 38，且扩增曲线指数期明显

可疑：38 < Ct < 40，建议复测

阴性：Ct ≥ 40 或无扩增

性能参数

灵敏度：检测限（LOD）≤ 100 copies/mL

特异性：与柯萨奇病毒（CA16）、埃可病毒等无交叉反应

重复性：CV值 ≤ 5%（同一批内）

注意事项

实验分区操作：试剂配制区、样本处理区、扩增区严格分离

穿戴防护装备：实验服、手套、口罩，避免气溶胶污染

试剂解冻后需涡旋混匀，短暂离心后使用

熔解曲线分析（可选）：扩增结束后运行95℃→60℃→95℃（0.5℃/s），确认单一峰型

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