组链球菌染料法荧光定量PCR试剂盒

检测原理

基于SYBR Green染料法的实时荧光PCR技术，针对GBS基因高度保守区设计特异性引物，通过荧光信号实时监测核酸扩增，实现定性及定量分析。

适用样本类型：临床样本（如阴道分泌物、尿液、血液等）、食品或环境样本中的GBS核酸检测。

试剂盒组成

PCR预混液：含SYBR Green荧光染料、dNTPs、Taq DNA聚合酶及优化缓冲体系。

GBS特异性引物：针对目标基因设计的上下游引物（冻干粉或预混液形式）。

阳性对照：已知浓度的GBS DNA片段（非活体样本，避免生物污染风险）。

阴性对照：无核酸酶水或无关DNA模板。

模板稀释液：用于标准曲线制备或样本稀释。

操作步骤

1. 样本前处理

临床样本：按规范提取DNA（如使用柱式提取法或磁珠法），建议最终DNA浓度调整至10–100 ng/μL。

对照稀释：阳性对照需梯度稀释（如10^2–10^7拷贝/μL），每个稀释度单独使用带滤芯枪头操作，避免交叉污染。

2. PCR反应体系配制（以20 μL体系为例）

| 组分 | 体积（μL） |

| PCR预混液 | 10 |

| 引物混合液 | 2 |

| 模板DNA | 2 |

| 无核酸酶水 | 6 |

注意事项：

反应需设置技术重复（建议≥3孔）及阴性对照（NTC）。

避免气泡产生，短暂离心后上机。

3. 荧光定量PCR程序

| 步骤 | 温度/时间 | 循环数 |

| 预变性 | 95℃, 3 min | 1 |

| 变性 | 95℃, 15 s | 40 |

| 退火/延伸 | 60℃, 30 s | |

| 熔解曲线分析 | 60–95℃ | 1 |

4. 结果判读

定性分析：Ct值≤35且熔解曲线为单一峰，判为阳性；无Ct值或熔解曲线异常为阴性。

定量分析：通过标准曲线计算样本中GBS核酸拷贝数。

性能参数

灵敏度：可检测低至10拷贝/μL的GBS DNA。

特异性：不与A组链球菌或其他常见病原体核酸交叉反应。

线性范围：10^2–10^7拷贝/μL（R²≥0.99）。

储存与有效期

储存条件：-20℃避光保存，避免反复冻融（解冻后需短暂离心混匀）。

有效期：12个月。

注意事项

实验分区操作（样本处理、PCR配制、扩增区分离），防止污染。

阳性对照需最后加入，并使用专用耗材。

熔解曲线异常可能提示引物二聚体或非特异性扩增，需优化条件。

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