肉毒梭状芽孢杆菌B型外毒素基因染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

预期用途

本试剂盒采用SYBR Green I染料法荧光定量PCR技术，定性检测食品、环境样本或临床样本中肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）B型神经毒素基因（BoNT/B）。适用于食品安全监测、生物反恐及临床病原体快速筛查。

检测原理

核酸提取：样本中DNA经提取纯化后作为模板。

qPCR扩增：

特异性引物靶向BoNT/B基因保守区域。

SYBR Green I染料嵌入双链DNA，荧光信号随扩增循环数增加而增强。

实时监测：通过荧光阈值（Ct值）判定目标基因是否存在。

试剂盒组成

| 组分 | 规格（100T） | 保存条件 |

| 2× SYBR Green qPCR Master Mix | 1.25 mL × 2 | -20℃避光 |

| BoNT/B 引物混合液（干粉） | 2管 | -20℃（复溶后）|

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | -20℃ |

| BoNT/B 阳性对照（质粒DNA） | 50 μL (10⁴ copies/μL) | -20℃ |

| RNase-Free水 | 1 mL | 室温 |

需自备材料

核酸提取试剂盒

荧光定量PCR仪（支持SYBR Green通道）

离心机、涡旋振荡器、移液器及无菌吸头

0.2 mL PCR管或96孔板

操作步骤

1. 样本处理

食品/环境样本：按标准方法（如ISO/TS 17919）提取DNA。

临床样本：使用病原体DNA提取试剂盒处理。

2. 试剂配制（冰上操作）

引物复溶：向干粉管加入250 μL RNase-Free水，涡旋混匀。

反应体系（20 μL/反应）：

| 组分 | 体积 |

| 2× SYBR Green Master Mix | 10 μL |

| BoNT/B 引物混合液 | 0.8 μL |

| DNA模板 | 2 μL |

| RNase-Free水 | 补足至20 μL |

3. qPCR程序设置

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 信号采集 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 | 关闭 |

| 扩增 | 95℃ | 15 sec | 40 | 开启 |

| | 60℃ | 30 sec | | |

| 熔解曲线 | 65℃→95℃ | 0.5℃/sec | 1 | 连续采集 |

结果判读

阳性：

Ct值 ≤ 35.0，且熔解曲线峰值温度与阳性对照一致（预期Tm：85±1℃）。

可疑：

Ct值 35.1–38.0，需重复检测确认。

阴性：

Ct值 ≥ 38.0 或无扩增曲线。

注：阴性对照应无扩增（Ct=40），阳性对照Ct值需≤30。

检测性能

灵敏度：最低检出限10 copies/反应。

特异性：

可检出C. botulinum B型，不交叉反应A、E、F型及其他梭菌（如C. perfringens）。

经验证菌株：ATCC 7949（B型）、ATCC 3502（A型）、ATCC 35415（E型）。

注意事项

分区操作：核酸提取、体系配制、扩增区需物理隔离。

避免污染：使用无菌耗材，穿戴防护装备。

试剂保存：Master Mix避光解冻，避免反复冻融。

熔解曲线分析：必需步骤，排除非特异性扩增。

局限性

仅检测BoNT/B基因，不区分活菌/死菌。

高腐殖酸样本可能抑制PCR，建议进行DNA纯度检测（A260/A280）。

公司正在出售的产品