肉毒梭状芽孢杆菌F型外毒素基因染料法荧光定量PCR试剂盒

产品用途

本试剂盒用于定性及定量检测食品、环境样本（如土壤、污水）或临床标本中 肉毒梭状芽孢杆菌F型 的 BoNT/F 神经毒素基因（bont/F）。适用于食品安全监测、临床中毒诊断及生物反恐应急检测。

检测原理

靶基因：BoNT/F型特异性基因片段（bont/F）

方法：SYBR Green I 染料法荧光定量PCR

SYBR Green嵌入双链DNA发出荧光，实时监测扩增进程

通过熔解曲线分析（Tm值）验证产物特异性

内参：内源性内标（Internal Control, IC）监控抑制物与操作误差

试剂盒组分

| 组分 | 规格 | 保存条件 |

| qPCR Master Mix | 1.2 mL（预混SYBR Green I, dNTPs, Taq酶） | -20℃避光 |

| BoNT/F引物混合液 | 200 μL（F/R引物，10 μM） | -20℃ |

| IC内标溶液 | 100 μL（内源性对照DNA） | -20℃ |

| 阳性对照（BoNT/F DNA） | 50 μL（1×10⁴ copies/μL） | -20℃ |

| 阴性对照（无核酸水） | 1 mL | 室温 |

| RNase-Free水 | 1 mL × 2管 | 室温 |

技术参数

| 项目 | 性能 |

| 检测限（LOD） | 10 copies/反应 |

| 线性范围 | 10² ~ 10⁸ copies/μL（R² > 0.99） |

| 特异性 | 仅识别F型 bont 基因（不交叉反应A/B/E型及其他梭菌） |

| 重复性 | CV ≤ 3%（批内/批间） |

| 熔解曲线Tm值 | 86.5±0.5℃（BoNT/F产物） |

操作流程

样本前处理

DNA提取：使用商业核酸提取试剂盒（如QIAamp DNA Mini Kit）

模板制备：每反应使用2-5 μL DNA模板

qPCR反应体系

| 组分 | 体积（μL） |

| qPCR Master Mix | 10 |

| BoNT/F引物混合液 | 2 |

| IC内标溶液 | 1 |

| 模板DNA | 2-5 |

| RNase-Free水 | 补至20 |

扩增程序（ABI 7500等仪器）

| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |

| 预变性 | 95℃ | 5 min | 1 |

| 变性 | 95℃ | 15 sec | 40 |

| 退火/延伸 | 60℃ | 45 sec | |

| 熔解曲线 | 60℃→95℃（+0.3℃/sec） | — | 1 |

结果判读

阳性：

FAM通道Ct值 ≤ 38.0

熔解曲线Tm值符合86.5±0.5℃

可疑：Ct值在38.0~40.0 → 建议重复检测

阴性：无Ct值或Ct > 40.0

质量控制

阳性对照：必须出现典型S扩增曲线（Ct≤30）

阴性对照：无扩增信号（Ct值无效）

内标（IC）：所有样本IC通道Ct值应≤35，否则需重提DNA

注意事项

生物安全：

肉毒毒素为生物危害Ⅰ类病原体！操作需在BSL-2实验室进行

废弃物需121℃高压灭菌30分钟

操作规范：

分装试剂，避免反复冻融

反应体系配制需在超净台进行，防止气溶胶污染

储存条件：

未开封试剂盒-20℃保存12个月

解冻后Master Mix避光4℃保存≤1周

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