马痘病毒染料法荧光定量PCR试剂盒 新品

适用样本类型及前处理要点

样本类别 具体样本示例 前处理关键步骤

临床样本 病马皮肤痘疹渗出液、鼻腔分泌物、血液（EDTA抗凝） ① 皮肤渗出液：直接取50μL加DNA裂解液，100℃加热10min

② 血液：3000rpm离心5min取沉淀，CTAB法提取DNA

组织样本 病变皮肤组织、淋巴结、肺脏匀浆 液氮研磨后加1mL生理盐水制成悬液，13000rpm离心3min取沉淀，用病毒DNAout试剂裂解

环境样本 厩舍表面拭子、饲料残留、饮水 拭子用2mL生理盐水洗脱，8000rpm离心3min取上清，二次离心（13000rpm，5min）后沉淀裂解

试剂盒组成

组分 规格 用途

2×qPCR MagicMix（棕色管） 500μL 含热启动DNA聚合酶、SYBR Green染料、dNTP

马痘病毒引物混合液（白盖） 100μL (10μM) 特异性扩增靶基因保守区

阳性对照（红盖） 50μL (1×10⁸拷贝/μL) 验证反应有效性（无传染性DNA片段）

荧光PCR专用模板稀释液（黄盖） 1mL 稀释阳性对照及样本模板

DNA病毒裂解液（试用装） 9mL（15次用量） 快速裂解病毒释放DNA

操作流程

1. 样本DNA提取（样本制备区）

液体样本（如渗出液、血液）：取100μL加50μL DNA裂解液，100℃加热10min，13000rpm离心3min，取上清5μL作为模板。

组织/拭子样本：按“样本类型表”处理后，用试剂盒配套裂解液或柱提法提取DNA，确保A260/A280比值在1.8-2.0。

2. 阳性对照稀释（独立区域，避免污染）

标记6个离心管（2-7号），各加45μL模板稀释液；

7号管加5μL阳性对照（1×10⁸拷贝/μL），梯度稀释至2号管（1×10³拷贝/μL），形成标准曲线。

3. 反应体系配制（20μL/管）

2×qPCR MagicMix        10μL  

马痘病毒引物混合液      2μL  

模板DNA（样本/对照）    5μL  

无酶水                  3μL  

阴性对照：用无酶水替代模板；

阳性对照：取各稀释度标准品5μL。

4. 扩增程序

步骤 温度 时间 循环数

预变性 95℃ 10分钟 1次

变性 95℃ 15秒 40次

退火延伸（采集荧光） 60℃ 1分钟 40次

溶解曲线分析 65℃→95℃ 每0.5℃停留5秒 1次

结果判读标准

阳性：Ct≤35，溶解曲线单一峰值（Tm=86±1℃）；

可疑：35<Ct<38，需重新提取DNA验证；

阴性：Ct≥38或无扩增（阴性对照无Ct值）。

注意事项

防污染：阳性对照稀释需在独立区域操作，使用带滤芯吸头，PCR产物区与试剂准备区分开；

样本保存：新鲜样本4℃保存不超过24小时，-20℃可保存1周，避免反复冻融；

仪器兼容性：适用于ABI、Bio-Rad、LightCycler等荧光定量PCR仪，ABI 7500等需添加ROX参比染料。

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