人胚肾细胞-绿色荧光蛋白标记;HEK293T-EGFP-PURO 新品

                                                          人胚肾细胞-绿色荧光蛋白标记;HEK293T-EGFP-PURO
产品信息：

1. 细胞背景与基本特性

母本细胞：HEK293T (人胚肾细胞)

种属来源：人 (Homo sapiens)

组织来源：胚胎肾

关键改造：表达 SV40 Large T 抗原（允许含有 SV40 复制起点的质粒进行复制，提高蛋白表达量）。

生长特性：贴壁生长

细胞形态：上皮细胞样（多边形，铺路石状）

标记基因：

EGFP：增强型绿色荧光蛋白，在蓝光激发下发出明亮的绿色荧光。

Puro：嘌呤霉素抗性基因，用于维持筛选压力，防止荧光基因丢失。

应用领域：慢病毒/腺病毒包装、荧光显微镜成像对照、活体动物成像、细胞共培养示踪。

2. 核心参数速览

特征  描述

培养基  DMEM (高糖) + 10% FBS

生长状态  贴壁生长 (上皮样)

传代比例  1:3 ～ 1:6

消化时间  1-2 分钟 (胰酶消化)

冻存条件  90% FBS + 10% DMSO 或专用无血清冻存液

3. 详细培养操作指南

HEK293T-EGFP-Puro 的培养方式与普通 HEK293T 细胞基本一致，主要区别在于培养基中通常需要添加筛选抗生素以维持荧光的稳定表达。

基础培养条件

温度：37℃

气体环境：95% 空气 + 5% CO

湿度：饱和湿度

推荐培养基配方

基础培养基：DMEM (高糖)（含 4.5g/L 葡萄糖）。

血清：10% 胎牛血清 (FBS)。

双抗：1% 青霉素-链霉素 (P/S)（可选，视实验要求而定）。

筛选抗生素：嘌呤霉素 (Puromycin)。

注意：为了维持 EGFP 的稳定表达，建议在培养基中添加嘌呤霉素。通常维持浓度为 0.5 - 1.0 μg/mL（具体浓度需参考构建时的筛选浓度）。

传代操作 (当细胞密度达 80%-90% 时)

HEK293T 细胞贴壁较松，消化时间短。

弃液：吸去旧的培养上清液。

润洗：加入适量不含钙、镁离子的 PBS 缓冲液，轻轻晃动润洗细胞层 1 次，弃去 PBS。

消化：加入 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化液（T25 瓶加 1 mL），置于 37℃ 培养箱中消化 1-2 分钟。

注意：HEK293T 细胞贴壁较松，通常无需等待细胞完全变圆脱落，轻轻敲打培养瓶壁，细胞即可脱落。

终止：加入含血清的完全培养基终止消化。

离心与分装：将细胞悬液转移至离心管，1000 rpm 离心 5 分钟。弃上清，重悬后按 1:3 至 1:6 的比例分装到新瓶中。

冻存与复苏

冻存液：推荐使用 90% FBS + 10% DMSO，或专用的无血清冻存液。

复苏：37℃ 水浴快速摇晃解冻，立即转移至含完全培养基的离心管中混匀，离心去除上清（去除 DMSO），重悬后接种。

4. 注意事项与常见问题

运输中的脱落（常见问题）：

HEK293T 细胞贴壁能力较弱，运输途中极易脱落。收到细胞后，如果发现瓶底无细胞或细胞极少，请务必离心运输培养基，将管底沉淀的细胞团块重悬接种，不要直接丢弃。

荧光观察：

在荧光显微镜的 GFP 通道下观察，健康的细胞应呈现均匀、明亮的绿色荧光。如果荧光变暗，可能是抗性丢失或细胞状态不佳。

筛选压力：

如果在培养过程中去除了嘌呤霉素（Puromycin），生长较快的非荧光细胞可能会占据优势，导致整体荧光强度下降。建议在实验对照组中保持抗生素筛选。

细胞状态：

HEK293T 细胞对密度敏感，不宜长满度过高（超过 90%）再传代，否则容易聚团且状态变差。

总结：HEK293T-EGFP-Puro 是一种贴壁生长的标记细胞系。它的培养关键在于回收运输后脱落的细胞以及添加嘌呤霉素（PURO）以维持绿色荧光蛋白表达。该细胞系是病毒包装和荧光示踪的得力助手。

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细胞具体特点如下：

环境与营养：需无菌环境、精确的温度（36-37℃）和pH（7.2-7.4），动物细胞常需血清，植物细胞需激素。

生长方式：贴壁细胞需表面附着，悬浮细胞自由漂浮，半贴壁半悬浮兼具两者特性。

传代与密度：贴壁细胞需胰酶消化传代，悬浮细胞直接分瓶；密度达80%-90%时需传代，避免营养枯竭与代谢抑制。

敏感性：对剪切应力、污染、温度变化敏感，需定期更换培养液清除代谢物。

应用与局限：便于活细胞观察与实验控制，但体外环境与体内存在差异，长期传代可能导致遗传不稳定与去分化。