G4 EA H1N1猪流感病毒（G4 EA H1N1） 检测试剂盒(双重荧光-PCR 法)

该试剂盒采用 双重实时荧光定量 RT-PCR（TaqMan 探针法） 技术，通常采用“双靶标确认”策略，以确保检测的准确性。

靶标设计：

G4 EA 特异性基因（FAM 通道）：针对 G4 EA H1N1 病毒特有的内部基因片段（如 M 基因或特定的重组 HA 基因保守区）设计特异性引物和探针。这是区分普通 H1N1 和 G4 EA H1N1 的关键。

H1N1 通用基因（VIC/HEX 通道）：针对甲型流感病毒 H1N1 亚型的保守基因（如 NP 或 M 基因）设计引物探针，用于确认样本中是否存在 H1N1 病毒感染。

结果逻辑：

只有当 FAM 通道（G4 EA 特异） 和 VIC 通道（H1N1 通用） 同时呈阳性时，才能判定样本为 G4 EA H1N1 阳性。这种设计有效避免了非特异性扩增导致的假阳性。

 2. 试剂盒组成

以常见的 50 测试/盒规格为例，主要包含以下组分：

组分名称 描述 保存条件

2× qRT-PCR Mix 含 dNTPs、缓冲液、Mg2、热启动 Taq 酶 -20℃ 避光保存

Enzyme Mix 逆转录酶（RTase）和 RNase 抑制剂 -20℃ 保存

Primer/Probe Mix G4 EA 特异性引物探针 + H1N1 通用引物探针混合液 -20℃ 避光保存

阳性对照 (Positive Control) 含 G4 EA 和 H1N1 目标片段的质粒混合液 -20℃ 保存

阴性对照 (Negative Control) 无核酸酶水 (Nuclease-free Water) 4℃ 或 -20℃ 保存

 3. 适用范围与背景

检测对象：主要针对G4 EA H1N1 猪流感病毒核酸。

应用领域：

猪场疫病监测：监测猪群中 G4 EA H1N1 的流行情况。

人畜共患病研究：检测职业暴露人群（如养猪场工人）的呼吸道样本，评估跨物种传播风险。

环境监测：检测猪场环境（如空气、粪便、运输车辆）中的病毒残留。

样本类型：猪鼻咽拭子、口鼻拭子、肺组织匀浆、环境棉拭子等。

灵敏度：最低检测限通常可达 1×103 拷贝/mL，能够检测出极微量的病毒。

 4. 操作流程简述

样本前处理与核酸提取：

使用病毒 RNA 提取试剂盒从采集的拭子或组织液中提取总 RNA。

反应体系配置：

在冰浴上将 2× Mix、Enzyme Mix、引物探针混合液按比例混合。

分装至 PCR 八联管或 96 孔板中，加入提取好的 RNA 模板。

上机扩增：

程序设置（典型参数）：

逆转录：50℃ 15-30 分钟（一步法）。

预变性：95℃ 3-5 分钟。

PCR 扩增（40-45 个循环）：95℃ 15 秒 → 60℃ 30-60 秒（采集荧光）。

结果判读：

G4 EA H1N1 阳性：FAM 通道和 VIC 通道均出现典型的 S 型扩增曲线，且 Ct 值 ≤ 35-40。

阴性：两个通道均无扩增曲线，或 Ct 值 > 40。

无效：阳性对照未扩增，或阴性对照出现扩增。

 5. 关键注意事项

严格的防污染措施：

PCR 检测对污染极其敏感。实验室必须严格分区（试剂准备区、样本制备区、扩增区），严禁物品交叉使用。

严禁在扩增区打开扩增后的 PCR 管盖，以防气溶胶污染。

储存与运输：

试剂盒通常需要 -20℃ 避光保存。

避免反复冻融：反复冻融会降低酶活性，建议按单次使用量分装保存。

生物安全：

G4 EA H1N1 具有潜在的人畜共患风险，处理疑似阳性样本时，需在生物安全二级（BSL-2）或以上实验室进行，实验人员需做好二级防护（N95口罩、护目镜、防护服）。