H14 亚型流感病毒检测试剂盒 新品

该试剂盒通常采用实时荧光定量 RT-PCR（qPCR）技术，具体为 TaqMan 探针法。

核心原理：

靶基因：针对 H14 亚型流感病毒基因组中血凝素（HA）基因的高度保守区域设计特异性引物和探针。

检测机制：在PCR扩增过程中，荧光探针与模板结合并被酶切降解，释放荧光信号（通常为FAM荧光素）。仪器实时监测荧光信号的累积，从而实现对病毒核酸的定性或定量检测。

特异性：优秀的试剂盒能将 H14 亚型与其他禽流感亚型（如 H5、H7、H9 等）区分开，避免交叉反应。

 2. 试剂盒组成 (典型配置)

一个标准的 50 次（50T）试剂盒通常包含以下组分：

组分名称 规格 (示例) 作用 保存条件

PCR 反应液 500 μL (2×) 含 dNTPs、Mg2、缓冲液 -20℃

酶混合液 50 μL 含逆转录酶、Taq DNA 聚合酶 -20℃

H14 特异性引物/探针混合液 50 μL 识别 H14 亚型特异序列 -20℃

阳性对照 50 μL 含 H14 靶基因片段的质粒 (高浓度) -20℃

阴性对照 100 μL 无菌生理盐水或缓冲液 -20℃

内标 (Internal Control, IS) 50 μL 监控样本提取和扩增过程是否正常 -20℃

 3. 适用样本与操作流程

适用样本类型：

禽类拭子：鸡、鸭、鹅、鸽子的咽喉拭子、泄殖腔拭子。

组织样本：病死禽的肺脏、脾脏、脑组织、气管等研磨液。

环境样本：活禽交易市场环境涂抹样本、污水。

操作流程详解：

第一步：样本采集与处理

使用无菌棉拭子采集禽类咽喉或泄殖腔分泌物，放入含病毒保存液（VTM）的采样管中，充分震荡洗脱。

第二步：病毒 RNA 提取

使用病毒 RNA 提取试剂盒（如磁珠法或柱提法）从样本液中提取总 RNA。

注意：此步骤需防止 RNA 酶降解，建议在生物安全柜中操作。

第三步：PCR 反应体系配置 (20 μL 体系示例)

在冰上配制反应混合液：

2× qPCR Mix: 10 μL

引物/探针混合液: 1 μL

酶混合液: 0.4 - 1 μL

模板 RNA: 5 - 10 μL

无核酸酶水: 补足至 20 μL

第四步：上机扩增

仪器设置：荧光通道选择 FAM（用于检测病毒），若含内标则选择 VIC/HEX 通道。

反应程序：

逆转录：42℃ - 50℃ (30-60 分钟)

预变性：95℃ (2-5 分钟)

循环扩增：95℃ 15秒 → 60℃ 30-60秒 (采集荧光)，进行 40-45 个循环。

第五步：结果判读

阳性 (+)：FAM 通道出现典型的“S”型扩增曲线，且 Ct 值 ≤ 38。

注：Ct 值越小，表示样本中病毒含量越高。

可疑 (±)：38 < Ct 值 ≤ 40，建议复测。

阴性 (-)：FAM 通道无扩增曲线，或 Ct 值 > 40。

 4. 关键注意事项

防污染 (重中之重)：

PCR 实验室必须严格分区（试剂准备区、样本制备区、PCR 扩增区）。

阳性对照含有高浓度的病毒核酸片段，极易造成气溶胶污染，导致假阳性。操作时必须小心，加完样后立即密封离心。

试剂保存：

试剂盒通常需要 -20℃ 避光保存。

严禁反复冻融。反复冻融会降低酶的活性，导致灵敏度下降。

生物安全：

禽流感病毒属于动物源性病原微生物，样本处理应在生物安全二级（BSL-2）实验室进行，操作人员需做好个人防护。

适用范围：

大多数此类试剂盒属于 “仅限科研 (RUO)” 或 “兽医诊断用”，不得用于人类临床诊断。

 总结

H14 亚型流感病毒检测试剂盒是一种利用荧光 PCR 技术检测禽流感病毒 H14 亚型的高灵敏度工具。它通过特异性引物和探针识别病毒的 HA 基因，帮助兽医或科研人员快速判断样本中是否含有该亚型病毒。在使用时，务必严格遵守防污染规范，并注意试剂盒的保存条件和适用范围。