H5/H7 亚型禽流感病毒检测试剂盒 新品

H5/H7 亚型禽流感病毒检测试剂盒

试剂简介：

检测目标：

FAM通道： H5亚型禽流感病毒（靶向HA基因）。

VIC/HEX通道： H7亚型禽流感病毒（靶向HA基因）。

注：部分试剂盒可能包含内源性内标（IC）通道，用于监控提取过程。

主要应用：

兽医诊断： 家禽（鸡、鸭、鹅）的临床样本检测。

环境监测： 活禽交易市场、养殖场环境（粪便、污水、笼具）的病原学监测。

科研与检疫： 病毒分离株的鉴定、流行病学调查。

 2. 检测原理

该试剂盒采用双重实时荧光定量RT-PCR（TaqMan探针法）技术：

一步法反应： 在同一个PCR反应管中，同时进行逆转录（RT）和PCR扩增。

双重检测： 反应体系中包含两组特异性引物和探针。

H5特异性探针： 5'端标记FAM荧光素。

H7特异性探针： 5'端标记VIC（或HEX）荧光素。

信号分离： 仪器实时监测不同通道的荧光信号，从而判断样本中是否含有H5、H7或两者共感染。

3. 试剂盒组成 (以50测试规格为例)

组分名称 规格/体积 保存条件 功能说明

H5/H7 PCR反应液 含引物/探针/dNTPs -20℃避光 预混液，包含H5和H7的特异性引物探针

酶混合液 含逆转录酶/Taq酶 -20℃ 催化逆转录和扩增反应

阳性对照 (混合) 50μL x 1管 -20℃ 含H5和H7目的基因的质粒混合物

阴性对照 250μL x 1管 4℃或-20℃ 无菌双蒸水或缓冲液

说明书 1份 常温 操作指南及判读标准

 4. 操作流程详解

第一步：样本采集与处理

样本类型：

拭子： 咽喉拭子、泄殖腔拭子。

组织： 脾、肺、气管、脑等脏器。

液体： 粪便悬液、气管冲洗液、鸡胚尿囊液。

处理方法：

拭子/组织需在PBS缓冲液中充分研磨、离心，取上清液作为待检样本。

第二步：核酸提取

方法： 使用配套的病毒RNA提取试剂盒（磁珠法或离心柱法）。

关键： 提取的RNA应溶解在无酶水中，避免含有PCR抑制剂。

第三步：PCR反应体系配制

解冻： 将反应液和酶液在冰上解冻，振荡混匀并瞬时离心。

配制： 按说明书比例混合PCR反应液和酶混合液。

分装： 将混合液分装至PCR反应管中（通常为20μL体系）。

第四步：加样

向反应管中加入提取好的RNA模板（通常为5-10 μL）。

注意： 设置阴性对照和阳性对照，加样过程需在冰上操作。

第五步：上机扩增

仪器： ABI 7500、LightCycler 480、Bio-Rad CFX96等。

通道设置：

Reporter Dye: FAM (H5), VIC/HEX (H7)

Quencher Dye: None

程序（参考）：

逆转录： 50℃ 10-15 min (1 cycle)

预变性： 95℃ 3-5 min (1 cycle)

PCR循环： 95℃ 15 sec → 60℃ 30-45 sec (40-45 cycles，采集荧光)

 5. 结果判读标准

有效实验判定：

阴性对照： FAM和VIC通道均无Ct值（或Ct值 > 40）。

阳性对照： FAM和VIC通道均有明显的扩增曲线，且Ct值符合说明书范围。

样本结果判定：

H5 (FAM通道) H7 (VIC通道) 结果判读 解释

Ct ≤ 35 Ct > 40 H5 阳性 感染H5亚型禽流感病毒

Ct > 40 Ct ≤ 35 H7 阳性 感染H7亚型禽流感病毒

Ct ≤ 35 Ct ≤ 35 混合感染 同时感染H5和H7亚型 (罕见)

Ct > 40 Ct > 40 阴性 未检测到H5或H7亚型

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