H5N1 亚型禽流感病毒检测试剂盒 新品

H5N1 亚型禽流感病毒检测试剂盒

1. 检测原理：

该试剂盒基于 TaqMan 荧光探针法（Real-time RT-PCR）。

双重靶标设计（亚型特异性）： 为了精准锁定 H5N1 病毒，试剂盒通常采用双重荧光 PCR技术，同时检测两个基因：

FAM 通道（H5 基因）： 针对 H5 亚型流感病毒的血凝素（HA）基因保守序列。

HEX/VIC 通道（N1 基因）： 针对 N1 亚型流感病毒的神经氨酸酶（NA）基因保守序列。

检测机制： 试剂盒利用逆转录酶将病毒 RNA 转化为 cDNA，再通过 Taq 酶进行扩增。只有当样本中同时检测到 H5 和 N1 的特异性荧光信号时，才能确诊为 H5N1 亚型禽流感病毒感染，这有效避免了与其他亚型（如 H5N2 或 H9N1）的混淆。

2. 检测目标与应用

目标病原： 高致病性禽流感病毒 H5N1 亚型（AIV-H5N1）。

应用领域：

动物疫病监测： 用于家禽养殖场、活禽交易市场的日常监测和净化。

临床辅助诊断： 用于疑似高致病性禽流感（“鸡瘟”）感染禽类的快速确诊。

公共卫生监测： 用于监测 H5N1 病毒向人的跨种传播风险。

样本类型： 咽喉拭子、泄殖腔拭子、血液、肺脏、脾脏等组织匀浆液。

3. 试剂盒组成（典型配置）

根据市场主流品牌的配置，试剂盒通常包含以下组分：

组分名称 规格/含量 作用

RT-PCR 反应液 / Master Mix 1 mL x 1管 (红盖) 含 dNTPs、缓冲液、Mg2等

酶混合液 (Enzyme Mix) 100 μL x 1管 (红盖/黑盖) 含逆转录酶、热启动 Taq 酶

引物/探针混合液 100 μL x 1管 (白盖) 针对 H5 和 N1 亚型特异性设计

阳性对照 (Positive Control) 50 μL x 1管 (黄盖) 含 H5N1 靶基因的质粒 (1×10^8 拷贝/μL)

阴性对照 (Negative Control) 1 mL x 1管 (亮黄色/蓝盖) 无菌超纯水

说明书 1 份 操作指南和参数说明

注：部分试剂盒可能将引物探针与反应液预混，或包含内标（Internal Control）以监控 PCR 抑制。

 4. 操作流程简述

样本处理： 采集拭子或组织样本，使用病毒 DNA/RNA 提取试剂盒提取病毒 RNA。

试剂配制（冰上操作）： 按照说明书比例（如 N+2 法，N 为样本数）混合反应液、酶和引物探针，分装到 PCR 管中。

加样： 向分装好的反应管中分别加入 5-10 μL 的模板 RNA（样本、阴性对照、阳性对照）。

上机扩增： 将 PCR 管放入荧光定量 PCR 仪中。

5. 反应程序与结果判读

推荐反应程序：

逆转录： 50℃，15-30 分钟。

预变性： 95℃，5-10 分钟。

PCR 循环： 95℃ 15 sec → 60℃ 30-45 sec（收集荧光），40-45 个循环。

结果判读标准：

阳性（+）：

FAM 通道和 HEX 通道均出现典型的 S 型扩增曲线。

且 Ct 值 ≤ 35（或说明书设定的阈值）。

结论：样本中检出 H5N1 亚型禽流感病毒核酸。

阴性（-）：

FAM 和 HEX 通道均无 Ct 值，或 Ct 值 > 35。

结论：样本中未检出 H5N1 亚型禽流感病毒核酸。

单重阳性（疑似/其他）：

仅 H5 阳性：提示可能存在 H5Nx（非 N1）亚型感染。

仅 N1 阳性：提示可能存在 HxN1（非 H5）亚型感染。

实验有效性：

阳性对照： FAM 和 HEX 通道均需有明显扩增（Ct 值在预期范围内）。

阴性对照： 无扩增曲线。

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