Mangshi 病毒检测试剂盒

该试剂盒采用 TaqMan 荧光探针法 进行检测。

核心原理：

靶基因：针对 Mangshi 病毒基因组的 L片段（RNA依赖的RNA聚合酶基因） 或 S片段（核衣壳蛋白基因） 设计特异性引物和探针。

检测过程：

逆转录（RT）：将样本中的病毒 RNA 反转录成 cDNA。

PCR 扩增：利用特异性引物对 cDNA 进行扩增。

荧光检测：探针结合到扩增产物上，随着扩增进行，探针被切断释放荧光信号。仪器实时监测荧光强度，从而判断样本中是否含有 Mangshi 病毒核酸。

 2. 试剂盒组成 (典型配置)

一个标准的 50 次（50T）试剂盒通常包含以下组分：

组分名称 规格 (示例) 作用 保存条件

PCR 反应液 500 μL (2×) 含 dNTPs、Mg2、缓冲液 -20℃

酶混合液 50 μL 含逆转录酶、Taq DNA 聚合酶 -20℃

MSV 特异性引物/探针混合液 50 μL 识别 Mangshi 病毒特异序列 -20℃

阳性对照 50 μL 含 MSV 靶基因片段的质粒 (高浓度) -20℃

阴性对照 100 μL 无菌水或缓冲液 2-8℃或-20℃

内标 (Internal Control, IS) 50 μL 用于监控提取和扩增过程是否正常 -20℃

 3. 适用样本与操作流程

适用样本类型：

组织样本：流产胎儿的脑组织、肺脏、脾脏、肾脏等。

血液样本：母猪的抗凝全血（血浆）或血清。

分泌物：鼻拭子、咽拭子。

操作流程详解：

第一步：样本采集与处理

采集病死猪或流产胎儿的组织样本，加入生理盐水研磨成匀浆；或直接采集血液样本。

第二步：病毒 RNA 提取

使用病毒 RNA 提取试剂盒（如磁珠法或柱提法）从样本液中提取总 RNA。

注意：此步骤至关重要，需防止 RNA 酶降解。

第三步：PCR 反应体系配置 (20 μL 体系示例)

在冰上配制反应混合液：

2× qPCR Mix: 10 μL

引物/探针混合液: 1 μL

酶混合液: 0.4 - 1 μL

模板 RNA: 5 - 10 μL

无核酸酶水: 补足至 20 μL

第四步：上机扩增

仪器设置：荧光通道通常选择 FAM（用于检测病毒）和 VIC/HEX（用于检测内标）。

反应程序：

逆转录：42℃ - 50℃ (30-60 分钟)

预变性：95℃ (2-5 分钟)

循环扩增：95℃ 15秒 → 60℃ 30-60秒 (采集荧光)，进行 40-45 个循环。

第五步：结果判读

阳性 (+)：FAM 通道出现典型的“S”型扩增曲线，且 Ct 值 < 35（或根据说明书设定阈值）。

阴性 (-)：FAM 通道无扩增曲线，或 Ct 值 > 40。

内标 (IS)：VIC 通道必须有正常扩增曲线（Ct 值 < 35），表明样本提取和扩增过程无抑制物干扰，结果才有效。

 4. 关键注意事项

防污染 (重中之重)：

PCR 实验室必须严格分区（试剂准备区、样本制备区、PCR 扩增区）。

阳性对照含有高浓度的病毒核酸片段，极易造成气溶胶污染，导致假阳性。操作时必须小心，加完样后立即密封离心。

试剂保存：

试剂盒通常需要 -20℃ 避光保存。

严禁反复冻融。反复冻融会降低酶的活性，导致灵敏度下降。

临床意义：

Mangshi 病毒常与猪蓝耳病病毒（PRRSV）混合感染，导致病情复杂化。如果临床出现母猪流产、死胎且蓝耳疫苗免疫正常，建议使用该试剂盒进行排查。

适用范围：

大多数此类试剂盒属于 “仅限科研 (RUO)” 或 “兽医诊断用”，严禁用于临床医疗。